張?zhí)锾?，沈明?/p>

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118)

PLACKETT-BURMAN設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基

張?zhí)锾?，沈明?

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118)

目的:借助MINITAB15.0，采用Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計法及響應(yīng)面分析法，對影響火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化研究。方法:首先利用Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計篩選出影響產(chǎn)酶的三個主要因素，即麥麩、葡萄糖和蛋白胨。在此基礎(chǔ)上用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域，再利用Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸分析。結(jié)果:麥麩、葡萄糖和蛋白胨與漆酶活力存在顯著的相關(guān)性，通過求解回歸方程得到優(yōu)化發(fā)酵條件:麥麩2.5%，葡萄糖2.0%，蛋白胨1.2%，pH自然。此時，漆酶活力達(dá)到最大值330.66U/mL，與初始設(shè)計發(fā)酵培養(yǎng)基中(238U/mL)相比漆酶活力提高了38.9%。結(jié)論:首次利用數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法優(yōu)化了火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基，并建立數(shù)學(xué)模型，為該菌株漆酶的工業(yè)應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

漆酶，響應(yīng)面法，Plackett－Burman，火紅密孔菌

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶(EC1.10.3.2)，廣泛存在于真菌、植物、細(xì)菌中［1－3］，但其中最主要的生產(chǎn)者是擔(dān)子菌中的白腐菌。漆酶與木素過氧化物酶、錳過氧化物酶同屬于木質(zhì)素降解酶類［4］。漆酶的作用底物非常廣泛，能催化酚、芳胺、羧酸等6大類250多種物質(zhì)發(fā)生羥基自由基介導(dǎo)的羥化、歧化、聚合等反應(yīng)［5］;特別是能有效降解環(huán)境污染物如二惡英、多氯聯(lián)苯、DDT等［6］。漆酶研究已有一百多年的歷史，是人類研究最早的酶之一，因其較強(qiáng)的氧化還原能力，和其在環(huán)境保護(hù)、生物檢測、造紙工業(yè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域中的應(yīng)用而受到人們的廣泛關(guān)注。實(shí)驗(yàn)菌株火紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr)來源于中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，是屬于擔(dān)子菌綱，多孔菌科的一種腐生真菌。已有文獻(xiàn)報道，該菌株可合成具有抗菌活性的物質(zhì)，且能生產(chǎn)多種具有工業(yè)價值的酶類［7］。漆酶是火紅密孔菌分泌的多種胞外酶的一種，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值，對偶氮、三苯甲烷和蒽醌素都有很好的降解作用［8］。目前，國內(nèi)極少見火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶營養(yǎng)條件的研究報道，本實(shí)驗(yàn)在Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計的基礎(chǔ)上，對影響火紅密孔菌產(chǎn)漆酶的麩皮、葡萄糖及蛋白胨三個主要因素進(jìn)行Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計，并采用響應(yīng)面分析法對三者之間的相互作用進(jìn)行了回歸分析，對漆酶的工業(yè)生產(chǎn)具有一定的參考價值。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果分析是由軟件MINITAB 15.0輔助完成的。

表1 N=12的Plackett－Burman的實(shí)驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)值

表2 Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計的因素水平及效應(yīng)分析

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

火紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr)

中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所;斜面種子培養(yǎng)基 馬鈴薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，VB10.001%，瓊脂2%;液體種子培養(yǎng)基 馬鈴薯20%，葡萄糖2%，酵母浸粉1%;初始設(shè)計發(fā)酵培養(yǎng)基 同液體種子培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng) 250m L三角瓶中裝液體培養(yǎng)基100m L，接入 6～7日齡平板菌種 3～5片(8mm)，130 r/m in、32℃下恒溫振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 粗酶液制備 取培養(yǎng)7～10d的發(fā)酵液，1000 r/m in離心10m in，上清即為粗酶液，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶活測定 參照吳涓［9］、王宜磊［10］的漆酶活力測定方法(略改):0.1mol/L pH4.6的醋酸緩沖液3.5m L，加入3.36mmo1/L的鄰聯(lián)甲苯胺0.5m L，再加入適當(dāng)稀釋的粗酶液0.1m L，25℃保溫5min，722E型紫外可見分光光度計測595nm處光密度(OD值)，酶活力以樣品與底物反應(yīng)5min后光密度的改變值表示，以每分鐘光密度增加0.001為一個酶活力單位(U/m L)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett－Burman設(shè)計篩選產(chǎn)酶重要影響因子

通過查閱大量文獻(xiàn)，并在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選取可能影響產(chǎn)酶的8個因素:葡萄糖(A)、淀粉(B)、麩皮(D)、酵母浸粉(E)、酒石酸銨(G)、蛋白胨(H)、MgSO4·7H2O(J)、KH2PO4(K)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)。8個因素分別對應(yīng)于表中的8個列，每個因素取低水平“－1”和高水平“1”。另設(shè)3個虛擬列，考察實(shí)驗(yàn)誤差。以漆酶活力為響應(yīng)值，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出各因素的t值和可信度水平。一般選擇可信度大于90%以上的因素作為重要因素。實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表1，各因素主效應(yīng)分析見表2。

由表2的主效應(yīng)分析結(jié)果可知，在PB設(shè)計的二水平范圍內(nèi)，影響火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的重要因素為葡萄糖、麩皮和蛋白胨的濃度，其可信度均在90%以上?？紤]到發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源均已確定，而其他因素對漆酶活力的影響不顯著，為避免實(shí)驗(yàn)資源的浪費(fèi)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成確定為麥麩、葡萄糖和蛋白胨。故在下一步響應(yīng)面分析中只考察麥麩、葡萄糖和蛋白胨濃度的最優(yōu)水平。

表5 回歸模型方差分析

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的臨近區(qū)域內(nèi)才能充分近似真實(shí)情形，所以要先逼近最佳區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程［11］。因此根據(jù)Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)篩選出的顯著因子，設(shè)計它們的變化方向及步長進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)是很有必要的，實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表3。由表3可知，最優(yōu)發(fā)酵條件可能在實(shí)驗(yàn)3附近，故以實(shí)驗(yàn)3的條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

2.3 響應(yīng)面設(shè)計確定顯著因子的最佳值

由最陡爬坡確定的實(shí)驗(yàn)因素中心點(diǎn)，根據(jù)Box－Behnken的中心組合設(shè)計原理，設(shè)計了三因素三水平運(yùn)行次數(shù)為15次的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。麥麩濃度x1(%)，葡萄糖濃度x2(%)和蛋白胨濃度x3(%)自變量經(jīng)過下述公式分別進(jìn)行編碼轉(zhuǎn)換:A=x1－2.5;B=x2－2;C=(x3－1.2)/0.2。實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表 4。9.00B－7.00C－25.17A2－64.17B2－61.17C2+22.00AC+6.00BC。其中Y為預(yù)計響應(yīng)值，A、B、C為變量的編碼值。

表4 響應(yīng)面Box－Behnken設(shè)計矩陣和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對結(jié)果進(jìn)行方差分析(表5)可知，方程的顯著統(tǒng)計程度較高，失擬項為0.335?0.05，模型決定系數(shù)R2=99.32%，表明回歸方程有較好的擬合度，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶進(jìn)行分析和預(yù)測。

對回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)可得模型的極值點(diǎn)，分別為:A=0.0230，麥麩濃度為2.523%，B=0.0678，葡萄糖濃度為2.068%，C=－0.0497，蛋白胨濃度為1.190%。其相對應(yīng)的響應(yīng)值為347.84U/m L?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將火紅密孔菌發(fā)酵培養(yǎng)基的成分在理論值基礎(chǔ)上修正為:麥麩2.5%，葡萄糖2.0%，蛋白胨1.2%，pH自然。在上述條件下對模型預(yù)測值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，漆酶活力為330.66U/m L，實(shí)驗(yàn)值與理論值誤差在5%之內(nèi)，屬正常范圍，可見模型可以較好地預(yù)測實(shí)際發(fā)酵情況。

根據(jù)回歸方程利用MINITAB 15.0繪出響應(yīng)面圖，即圖1～圖3。每個響應(yīng)面分別代表著兩個獨(dú)立變量之間的相互作用，此時第三個變量保持在最佳水平。由圖1顯示，蛋白胨含量為1.2%時，葡萄糖與麩皮含量對火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶活力的影響。由圖1可知，葡萄糖對漆酶活力的影響極其顯著，表現(xiàn)為較陡的曲面;麥麩含量對漆酶活力影響較小，曲面較平滑。圖2顯示，葡萄糖含量為2.0%時，麩皮與蛋白胨含量對漆酶活力的影響。由圖2可知，蛋白胨含量對漆酶活力的影響較為顯著，曲面變化幅度大;當(dāng)?shù)鞍纂撕枯^低，而麥麩含量較高時，顯著降低了漆酶的活力，不利于火紅密孔菌漆酶的分泌。圖3顯示了葡萄糖與蛋白胨交互作用對漆酶活力的影響。從圖3可以看出，葡萄糖和蛋白胨含量取某適中值時會使漆酶活力達(dá)到最大值，且過高或過低都會使漆酶活力降低。

利用統(tǒng)計軟件MINITAB 15.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸擬合，回歸模型為:Y=347.33+2.50A+

圖1 漆酶活力與葡萄糖，麥麩的響應(yīng)曲面圖

圖2 漆酶活力與蛋白胨，麥麩的響應(yīng)曲面圖

圖3 漆酶活力與蛋白胨，葡萄糖的響應(yīng)曲面圖

3 結(jié)論

火紅密孔菌是一種較為常見的腐生真菌，可導(dǎo)致木材的白色腐朽，廣泛存在于我國東北林區(qū)?；鸺t密孔菌在固體和液體發(fā)酵基質(zhì)中均可發(fā)酵生產(chǎn)漆酶。已有文獻(xiàn)報道，在誘導(dǎo)條件下火紅密孔菌可產(chǎn)生多種亞型的漆酶，且在最優(yōu)誘導(dǎo)條件下漆酶活力為1368U/L［12］。本文通過大量預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取對漆酶活力有影響且較為常見的碳源和氮源對火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對其他碳源而言，葡萄糖對漆酶活力影響較為顯著，而氮源中蛋白胨的影響較為顯著，這與方華等［13］的研究報道相一致。響應(yīng)面的結(jié)果顯示，葡萄糖濃度、蛋白胨濃度及麥麩濃度與漆酶活力存在顯著線性關(guān)系，其中葡萄糖濃度與麥麩濃度呈正相關(guān)，蛋白胨濃度呈負(fù)相關(guān)，表明高碳低氮有利于火紅密孔菌漆酶的分泌，而麥麩浸出液中豐富的營養(yǎng)成分也為漆酶的分泌提供了有利條件。圖1～圖3顯示，麥麩、葡萄糖和蛋白胨三者濃度均存在最佳值，在小于或大于最佳值時漆酶活力均有所下降?？赡茉蚴钱?dāng)濃度小于最佳值時，營養(yǎng)成分供給不足，菌體生長緩慢;而當(dāng)濃度大于最佳值時，菌體大量生長，兩者菌體密度均不適合發(fā)酵產(chǎn)酶，因此酶活力下降。

發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化是多因素多水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計，單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)工作量大且難以得到較快較好的結(jié)果。本文將Plackett－Burman設(shè)計與響應(yīng)面分析法相結(jié)合，可以快速、有效地從影響火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的因素中篩選出主要影響因素，避免了非主要因素可能造成的時間和資源的浪費(fèi)，并且可實(shí)現(xiàn)條件優(yōu)化，優(yōu)化的預(yù)測結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合性也較好。

經(jīng)過優(yōu)化，確定了火紅密孔菌的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:麥麩2.5%，葡萄糖2.0%，蛋白胨1.2%，pH自然。此時火紅密孔菌經(jīng)發(fā)酵所產(chǎn)漆酶的活力為330.66U/m L，與初始設(shè)計發(fā)酵培養(yǎng)基(238U/m L)相比漆酶活力提高了38.9%。本實(shí)驗(yàn)僅從培養(yǎng)基成分方面對火紅密孔菌產(chǎn)漆酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，不夠全面，培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)劑等方面的相關(guān)研究將會陸續(xù)進(jìn)行。

［1］Alexandre G，Zhulin IB.Laccases are widespread in bacteria［J］.Trends in Biotechnology，2000，18(2):41－42.

［2］蘭瑞芳，林少琴，林玉滿，等.杏鮑菇漆酶的生物學(xué)特性［J］.食用菌學(xué)報，2002，9(2):14－16.

［3］Wan Yun－Yang，Du Yu－Min，Yang Fang－Xing，et al.Purification and characterization of hydrosoluble components from the sap of Chinese lacquer tree Rhus vernicifera［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2006，38(3－5):232－240.

［4］池玉杰，伊洪偉.木材白腐菌分解木質(zhì)素的酶系統(tǒng)－錳過氧化物酶、漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶催化分解木質(zhì)素的機(jī)制［J］.菌物學(xué)報，2007，26(1):153－160.

［5］季立才，胡培植.漆酶催化氧化反應(yīng)研究進(jìn)展［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，1997，17(1):79－84.

［6］林鹿，龐春生，黃偉韓，等.自然水體介質(zhì)中白腐菌對二噁英類物質(zhì)的降解［J］.環(huán)境化學(xué)，2005，24(5):595－598.

［7］Lu Lei，Zhao Min，Zhang Bei－Bei，et al.Purification and characterization of laccase from Pycnoporus sanguineus and decolorization of an anthraquinone dye by the enzyme ［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74:1232－1239.

［8］Pointing SB，Vrijmoed LLP.Decolorization of azo and triphenyl methane dyes by Pycnoporus sanguineus producing laccase as the sole phenoloxidase［J］.World Journal of Microbiol＆ Biotechnol，2000，16:317－318.

［9］吳涓，肖亞中，王怡平，等.蜜環(huán)菌胞外漆酶酶活力的分光光度法測定［J］.廈門大學(xué)學(xué)報，2001，40(4):893－898.

［10］王宜磊，鄧振旭，朱陶，等.彩絨革蓋菌CV－8漆酶活性的初步研究［J］.微生物學(xué)雜志，1998，18(4):60－62.

［11］Li C，Bai JH，Cai ZL.Optimization of a cultural medium for bacteriocin production by Lactococcus lactis using response surface methodology［J］.Journal of Biotechnology，2002，93:27－34.

［12］Pointing SB，Jones EBG，Vrijmoed LLP.Optimization of laccase production by Pycnoporus sanguineus in submerged liquid culture［J］.Mycological Society of America，2000，92:139－144.

［13］方華，黃俊，陳瞾，等.白腐菌分泌漆酶的培養(yǎng)條件研究［J］.化學(xué)與生物工程，2008，25(8):30－33.

Optimization of culture medium for laccase production from Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr by Plackett－Burman design and response surface methodology

ZHANG Tian－tian，SHEN ming－h(huán)ao*

(College of Food Science and Engineering，Jilin Agriculture University，Changchun 130118，China)

Objective:Drawing assistance from mINITAB 15.0 software，Plackett－Burman experimental design and response surface methodology were applied to optimizing culture medium for laccase production from Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr.Method:The important factors influencing laccase production，which identified by initial experimental design of Plackett－Burman were wheat bran，glucose and pep tone.The path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the three significant factors.Box－Behnken design and response surface analysis were adopted to further investigate the mutual interaction between the variables and obtain optimal values that bring maximum laccase activity.Results:The results showed that wheat bran，glucose and pep tone all had significant influence on the activity of laccase.The optimal conditions for the maximal activity discriminated from the reg ressionequation were:wheat bran 2.5%，glucose 2.0%，pep tone 1.2%，natural pH.The maximum value was 330.66U/m L.Compared with the laccase activity(238U/m L)cultured in fermentation medium it increased 38.9% under the optimal conditions.Conclusion:Culture medium for Laccase production from Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr was optimized for the first time using statistics and the mathematical model for laccase production was established.

laccase;response surface methodology;Plackett－Burman;Pycnoporus Sanguineus(Fr.)

TS201.3

A

1002－0306(2011)09－0223－04

2010－09－01 *通訊聯(lián)系人

張?zhí)锾?1986－)，女，在讀碩士，研究方向:發(fā)酵工程，食品安全。

吉林省科技廳課題(20090553)。