林 琳，鄧 春，龍 柯，程 蓉，張永奎

(四川大學(xué)化工學(xué)院制藥與生物工程系，四川成都 610065)

氧載體在黃原膠發(fā)酵中的應(yīng)用

林 琳，鄧 春，龍 柯，程 蓉，張永奎*

(四川大學(xué)化工學(xué)院制藥與生物工程系，四川成都 610065)

黃原膠發(fā)酵過程中因發(fā)酵液粘度逐漸增加，系統(tǒng)供氧不足，導(dǎo)致黃原膠產(chǎn)率受到影響。為改善發(fā)酵系統(tǒng)供氧情況，提高黃原膠產(chǎn)率，本實(shí)驗(yàn)研究添加氧載體(大豆油、正己烷、正十二烷)對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:發(fā)酵初期添加6%(v/v)大豆油、發(fā)酵12h添加1%(v/v)正己烷，發(fā)酵72h，可分別顯著提高黃原膠產(chǎn)率至2.347%和2.927%，相對(duì)于空白組分別提高18%和47%;另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):大豆油組細(xì)胞干重有明顯提高，發(fā)酵72h后，仍能觀察到部分形態(tài)正常的細(xì)胞，延長發(fā)酵周期至84h，黃原膠產(chǎn)率顯著提高至2.977%，相對(duì)于空白組提高49%;正己烷組發(fā)酵72h，多數(shù)細(xì)胞自溶，延長發(fā)酵周期不能進(jìn)一步提高黃原膠產(chǎn)率，但加入正己烷使供氧情況得到改善，正己烷組細(xì)胞莢膜(即黃原膠)明顯厚于空白組。

黃原膠，發(fā)酵，氧載體，正己烷，大豆油

黃原膠是由野油菜黃單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)的酸性胞外多糖，是一種重要的工業(yè)生物高分子聚合物。黃原膠具有優(yōu)越的假塑性、觸變性和增粘性等，在食品、采油、化妝品等工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用［1－2］。野油菜黃單胞菌是好氧菌，在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，隨著粘度增大，物料混合以及氧分散能力大大下降，造成供氧不足，導(dǎo)致黃原膠產(chǎn)率難以提高。因此，溶氧濃度是整個(gè)發(fā)酵過程的重要限制因素。氧載體一般指不溶于培養(yǎng)基但能夠吸附或包裹氧的物質(zhì)，通過在發(fā)酵液中引入一種新液相(與發(fā)酵液互不相溶)，以減少氣液傳氧阻力，提高氧氣傳質(zhì)速率，這種液相一般具有比水更高的溶氧能力［3］。發(fā)酵系統(tǒng)中加入氧載體，可增強(qiáng)系統(tǒng)供氧能力，提高黃原膠產(chǎn)率，且無需額外提供能量［4－5］。大豆油［6－7］及碳?xì)浠衔铮?－9］常用作好氧發(fā)酵系統(tǒng)的氧載體，國內(nèi)雖有在黃原膠發(fā)酵系統(tǒng)中分別添加正己烷［10］和正十二烷［5］作為氧載體的報(bào)道，但未對(duì)各種氧載體進(jìn)行系統(tǒng)比較研究，且不夠深入。本實(shí)驗(yàn)以提高黃原膠產(chǎn)率為目的，考察常見的幾種氧載體(大豆油、正己烷、正十二烷)對(duì)黃原膠發(fā)酵體系的影響，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究所用菌種 本實(shí)驗(yàn)室保藏的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris);固體培養(yǎng)基(g/L) 蔗糖20、蛋白胨5、牛肉膏3、酵母膏1、瓊脂20，pH7.0;種子培養(yǎng)基(g/L) 蔗糖20、蛋白胨5、牛肉膏3、酵母膏1，pH7.0;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 蔗糖50、蛋白胨6、K2HPO45.0、MgSO4·7H2O 0.3、CaCO33.0、檸檬酸1，pH7.0;大豆油 上海嘉里公司;正己烷、正十二烷

成都科龍公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞干重測定 移取發(fā)酵液1m L，適當(dāng)稀釋，離心(10000 r/m in，15m in)，洗滌三次，60℃烘干至恒重，稱重。

1.2.2 黃原膠提取與含量測定 添加上清液質(zhì)量0.2%的氯化鉀，再添加3倍體積的無水乙醇，攪拌產(chǎn)

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察 野油菜黃單胞菌經(jīng)莢膜染色法染色［11］，顯微鏡觀察。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件 接種經(jīng)平板活化后的單菌落于種子培養(yǎng)基，裝液量 50m L/250m L，搖床培養(yǎng)(30℃，180 r/m in)28h;再以10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量20m L/100m L，在發(fā)酵的不同時(shí)期加入不同濃度的大豆油、正己烷、正十二烷，搖床發(fā)酵(30℃，180 r/m in)，提取黃原膠，計(jì)算產(chǎn)率。生黃原膠絮狀沉淀，過濾收集黃原膠沉淀。所得黃原膠60℃烘干至恒重，稱重，黃原膠產(chǎn)率按式(1)計(jì)算:

2 結(jié)果與討論

2.1 氧載體加入量對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響

發(fā)酵初期分別以2%、4%、6%、8%、10%和12%(v/v)加入量，添加大豆油、正己烷、正十二烷，搖床發(fā)酵(180 r/m in，30℃)72h，結(jié)果如圖1。隨著大豆油加入量的增加，黃原膠產(chǎn)率提高，當(dāng)添加6%(v/v)大豆油時(shí)，產(chǎn)率為2.347%，相對(duì)于空白組提高18%。然而，隨著加入量進(jìn)一步增大，黃原膠產(chǎn)率呈明顯下降趨勢，過量加入大豆油導(dǎo)致發(fā)酵液水分流失，且表觀粘度增大造成氧氣傳質(zhì)系數(shù)降低［12］。添加2%(v/v)以上的正己烷或正十二烷均使黃原膠產(chǎn)率下降，這可能是由于正己烷和正十二烷加入量過高，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用。降低正己烷和正十二烷加入量，結(jié)果如圖2。正己烷加入量降低后，黃原膠產(chǎn)率顯著提高，當(dāng)添加 1%(v/v)正己烷時(shí)，產(chǎn)率為2.413%，相對(duì)于空白組提高21%。但僅添加0.25%(v/v)正十二烷，黃原膠產(chǎn)率仍未提高且呈下降趨勢，正十二烷可能對(duì)黃原膠生物合成相關(guān)的某些酶系有不利影響，因此正十二烷不適合作為氧載體用于本系統(tǒng)中。

圖1 不同濃度氧載體(大豆油、正己烷、正十二烷)對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響

圖2 降低正己烷、正十二烷加入量對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響

2.2 氧載體加入時(shí)間對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響

分別于發(fā)酵 0、12、24、36、48、60h，向發(fā)酵系統(tǒng)中添加6%(v/v)大豆油或1%(v/v)正己烷，搖床發(fā)酵(180 r/m in，30℃)72h，結(jié)果如圖3。隨著大豆油加入時(shí)間的推后，黃原膠產(chǎn)率逐漸下降，而發(fā)酵12h添加正己烷，產(chǎn)率為2.927%，相對(duì)于空白組提高47%。一般而言，有機(jī)溶劑的Log P(在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下，溶劑在辛醇和水兩相系統(tǒng)中分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值)大于4表明其具有良好的生物相容性，對(duì)微生物細(xì)胞沒有毒害作用［13］。而正己烷Log P為3.5，故在細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境(發(fā)酵12h)后添加正己烷，能削弱其對(duì)細(xì)胞的毒害作用。

圖3 氧載體加入時(shí)間對(duì)黃原膠產(chǎn)率的影響

發(fā)酵過程中生物量隨時(shí)間的變化如圖4所示?？梢钥闯?，大豆油組最高細(xì)胞濃度為10.933g/L，遠(yuǎn)高于空白組最高細(xì)胞濃度6.233g/L，說明發(fā)酵初期添加6%(v/v)大豆油有利于改善供氧，對(duì)細(xì)胞生長有明顯促進(jìn)作用。發(fā)酵12h添加1%(v/v)正己烷獲得的細(xì)胞濃度與空白組相差不大，而發(fā)酵初期添加1%(v/v)正己烷，細(xì)胞濃度降低，這進(jìn)一步驗(yàn)證了發(fā)酵初期加入正己烷對(duì)細(xì)胞的毒害作用。

圖4 氧載體加入對(duì)黃單胞菌生長的影響

2.3 發(fā)酵過程中細(xì)胞形態(tài)的變化

在黃原膠發(fā)酵的不同時(shí)期，取空白組、大豆油組(發(fā)酵初期加入6%(v/v)大豆油)及正己烷組(發(fā)酵12h加入1%(v/v)正己烷)發(fā)酵液，進(jìn)行細(xì)胞莢膜染色，用油鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖5。發(fā)酵初期，細(xì)胞外層幾乎沒有胞外多糖，即黃原膠;發(fā)酵24h，空白組和兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中均可觀察到有一層較薄的莢膜，說明發(fā)酵前期主要是細(xì)胞生長，而黃原膠還未大量生成;發(fā)酵48h，三組細(xì)胞外層莢膜顯著變厚，部分細(xì)胞出現(xiàn)自溶，細(xì)胞自溶釋放的胞內(nèi)酶雖對(duì)黃原膠合成有利，但細(xì)胞自溶標(biāo)志著發(fā)酵即將結(jié)束，因此黃單胞菌的莢膜厚度在細(xì)胞自溶后達(dá)到最大;發(fā)酵72h，空白組和正己烷組中多數(shù)細(xì)胞自溶，因加入正己烷改善發(fā)酵供氧情況，正己烷組的細(xì)胞莢膜明顯厚于空白組，大豆油組中雖有細(xì)胞自溶，但仍可觀察到部分形態(tài)正常的細(xì)胞，說明發(fā)酵還可繼續(xù)。為此，分別延長大豆油組和正己烷組的發(fā)酵周期，結(jié)果如圖6。延長大豆油組發(fā)酵周期至84h，產(chǎn)膠率顯著提高至2.977%，相對(duì)于空白組提高49%，說明大豆油組更高的產(chǎn)膠率可通過延長發(fā)酵周期獲得。延長正己烷組發(fā)酵周期不能進(jìn)一步提高黃原膠產(chǎn)率。

圖5 發(fā)酵過程中空白組(a)、大豆油組(b)、正己烷組(c)細(xì)胞形態(tài)的變化

圖6 延長發(fā)酵周期對(duì)黃原膠產(chǎn)率的影響

3 結(jié)論

3.1 大豆油、正己烷可作為黃原膠發(fā)酵系統(tǒng)的有效氧載體，發(fā)酵初期加入6%(v/v)大豆油、發(fā)酵12h加入1%(v/v)正己烷，產(chǎn)膠率分別為2.347%和2.927%，相對(duì)于空白組分別提高18%和47%。

3.2 加入量0.25%～12%(v/v)范圍內(nèi)的正十二烷不能提高黃原膠產(chǎn)率，對(duì)黃原膠發(fā)酵有抑制作用，因此正十二烷不適合作為氧載體用于本系統(tǒng)中。

3.3 發(fā)酵初期加入6%(v/v)大豆油，對(duì)細(xì)胞生長有明顯的促進(jìn)作用，最大細(xì)胞濃度為10.933g/L，并使細(xì)胞自溶滯后，因此延長發(fā)酵周期至84h，產(chǎn)膠率顯著提高至2.977%，相對(duì)于空白組提高49%。發(fā)酵12h加入1%(v/v)正己烷對(duì)細(xì)胞生長沒有促進(jìn)作用，也不能使細(xì)胞自溶滯后，但加入正己烷改善發(fā)酵供氧情況，使得細(xì)胞莢膜明顯厚于空白組。

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Application of oxygen vectors in xanthan gum production

LIN Lin，DENG Chun，LONG Ke，CHENG Rong，ZHANG Yong－kui*

(School of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China)

In xanthan gum fermentation process，the level of dissolved oxygen drops with the viscosity increasing，and the synthesis of xanthan gum is inhibited.Adding oxygen vectors to the system of xanthan gum fermentation is a method to imp rove oxygen supply.The optimalsoybean oilconcentration and adding time was 6%(v/v)and 0h，and the optimal n－h(huán)exane concentration and adding time was 1%(v/v)and 12h.The addition of soybean oil and n－h(huán)exane significantly improved xanthan gum yield to 2.977%and 2.927%，respectively(increased by 49%and 47%，respectively).Although partial autolysis occurred in the soybean oil group，synthesis could still continue in most normal cells by 72h，which made it possible to extend fermentation period.Prolonging fermentation with n－h(huán)exane had little effect on the yield，however the capsule around the cell was obviously much thicker than that of control group after 72h fermentation.

xanthan gum;fermentation;oxygen vector;n－h(huán)exane;soybean oil

TS201.3

A

1002－0306(2011)08－0192－03

2010－07－16 *通訊聯(lián)系人

林琳(1986－)，女，碩士研究生，主要從事微生物發(fā)酵方面研究。