戴易興，王洪新，呂文平，孫軍濤，秦曉娟

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122)

乳糖誘導(dǎo)基因工程菌產(chǎn)β-葡聚糖酶及其酶學(xué)特性的研究

戴易興，王洪新，呂文平*，孫軍濤，秦曉娟

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122)

考察了乳糖替代IPTG誘導(dǎo)重組大腸桿菌產(chǎn)β－葡聚糖酶的可行性，分別對(duì)乳糖作為誘導(dǎo)劑時(shí)的終濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間和溫度等方面進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，工程菌培養(yǎng)6h(OD600達(dá)到0.7左右)后，加入終濃度為10mmol/L的α－乳糖，升溫至41℃，誘導(dǎo)6h，酶活可達(dá)到830.7U/mL。與IPTG相比，酶活提高2倍左右，發(fā)酵周期縮短70%。該酶pH穩(wěn)定范圍較寬，熱穩(wěn)定性良好，在生理溫度(70℃左右)下活性高，說(shuō)明乳糖可以作為基因工程菌的高效誘導(dǎo)劑。關(guān)鍵詞:基因工程菌，β－葡聚糖酶，乳糖，IPTG，酶學(xué)特性

β－1，3－1，4－葡聚糖酶(EC3.2.1.73，以下簡(jiǎn)稱(chēng)β－葡聚糖酶)是一種內(nèi)切水解酶，主要來(lái)源于微生物，專(zhuān)一催化大麥β－葡聚糖或地衣多糖中臨近β－1，3和 β－1，4糖苷鍵的水解反應(yīng)。β－葡聚糖酶應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)中，可以分解大麥及麥芽中的β－葡聚糖凝膠，改善啤酒的混濁度，提高產(chǎn)品質(zhì)量［1］;應(yīng)用于制糖業(yè)中，可防治高粘性葡聚糖的形成，提高制糖業(yè)的提取率［2］;應(yīng)用于飼料中，可以消除β－葡聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高飼料的消化率，改善畜禽生產(chǎn)性能［3］。近年來(lái)，構(gòu)建質(zhì)粒含有T7啟動(dòng)子的基因工程菌，用于高效表達(dá)β－葡聚糖酶的技術(shù)已經(jīng)逐漸得到應(yīng)用。以往大多采用IPTG(異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷)作為工程菌的誘導(dǎo)劑，鑒于其昂貴的價(jià)格和潛在的毒性，低廉無(wú)毒的乳糖已經(jīng)逐漸替代IPTG成為一種新的誘導(dǎo)劑。有文獻(xiàn)報(bào)道［4］結(jié)合乳糖和IPTG協(xié)同誘導(dǎo)，更易實(shí)現(xiàn)β－葡聚糖酶的高效表達(dá)，也有研究者［5］采用含有乳糖的乳清粉作為培養(yǎng)基成分，大幅提高了發(fā)酵所得β－葡聚糖酶的活力。本研究室構(gòu)建的重組大腸桿菌E.coliBL21，產(chǎn)酶量大，耐熱性好，是生產(chǎn)β－葡聚糖酶的優(yōu)良菌株。本研究在前期優(yōu)化了適合該菌株產(chǎn)酶的最適半合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，比較了IPTG和α－乳糖兩種誘導(dǎo)劑發(fā)酵產(chǎn)β－葡聚糖酶的效果，確定了最佳誘導(dǎo)條件，并考察了所產(chǎn)酶的酶學(xué)特性，為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β－葡聚糖酶基因工程菌(E.coliBL21) 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存;種子培養(yǎng)基(g/L) 胰蛋白胨10，酵母浸膏5，NaCl 10，pH 7.0;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 麩皮6.7，玉米粉1.7，豆粕13.8，豆粉13.8，酵母粉7.0，NH4Cl7.0，Na2HPO4·12H2O3.0，MgSO4·7H2O 0.75，CaCl20.5，吐溫80 0.8%，自然pH，抗生素。

超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;氣浴恒溫?fù)u床 金壇市瑞華儀器有限公司;UV－2100分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 重組大腸桿菌E.coliBL21，在30mL種子培養(yǎng)基中，37℃ 200r/min搖床培養(yǎng)至OD600達(dá)到1.0左右。吸取300μL至裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，37℃ 200r/min搖床振蕩過(guò)夜，分別采用IPTG和α－乳糖兩種誘導(dǎo)劑，在不同濃度下進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.2.2 β－葡聚糖酶酶活的測(cè)定 樣品處理參照文獻(xiàn)［6］;酶活測(cè)定參照文獻(xiàn)［7］;酶活力單位定義:1mL酶液在70℃和pH7.6條件下，1min水解底物生成1μg還原糖(以葡萄糖計(jì))的量為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.3 菌體密度測(cè)定 適當(dāng)稀釋菌液于600nm下測(cè)吸光度，所得值和稀釋倍數(shù)的乘積即菌體密度OD600。1.2.4 目的蛋白表達(dá)量的測(cè)定 10%SDS－PAGE圖譜經(jīng)掃描，用凝膠分析系統(tǒng)分析測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的含量。

1.2.5 菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 分別向若干裝有30mL LB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中接入300μL一級(jí)種子液，37℃ 200r/min搖床培養(yǎng)，每隔1h取出一瓶，測(cè)定菌液在600nm下的OD600值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

按照1.2.5的方法，測(cè)定二級(jí)種子液的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。由圖1可知，菌種在0～1h以?xún)?nèi)，處于停滯期，1h后迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6h后處于穩(wěn)定期，10h后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期。發(fā)酵菌種的種齡以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期為宜，種齡過(guò)低菌株的其密度也低，整個(gè)發(fā)酵周期會(huì)延長(zhǎng)，產(chǎn)物表達(dá)量降低。過(guò)老的種子雖然菌量較多，但接種后會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降，菌體過(guò)早衰退［8］。因此我們選取OD600在1.0左右的菌種作為二級(jí)種子液。

圖1 重組大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.2 誘導(dǎo)劑及其濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

國(guó)外已有大量研究表明［9－11］，乳糖可以作為重組大腸桿菌的良好誘導(dǎo)劑。但國(guó)內(nèi)研究［12－13］報(bào)道，雖然乳糖誘導(dǎo)對(duì)于菌體的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，但它的誘導(dǎo)表達(dá)速度比IPTG慢，目的蛋白表達(dá)量不及IPTG。

采用1.2.1的方法，使IPTG終濃度分別達(dá)到0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、4.6、9.2mmol/L，α－乳糖的終濃度分別為2、4、6、8、10、12、14mmol/L。由結(jié)果可知，獲得最高酶活的IPTG終濃度為3.2mmol/L，α－乳糖終濃度為10mmol/L，但α－乳糖作為誘導(dǎo)劑所獲得的酶活普遍高于IPTG(圖2)。乳糖作為誘導(dǎo)劑時(shí)獲得的最大酶活，較IPTG為誘導(dǎo)劑下的酶活提高了近40%，表明可以考慮乳糖作為IPTG的替代品。這可能是由于乳糖同時(shí)起到了誘導(dǎo)劑和碳源的作用［14］，在菌體過(guò)夜生長(zhǎng)將碳源基本耗盡時(shí)，添加乳糖相當(dāng)于進(jìn)行補(bǔ)料，可再次提高菌體的生長(zhǎng)速度和對(duì)目的蛋白的表達(dá)，而且使產(chǎn)物可溶性升高［15］。

圖2 誘導(dǎo)劑及其濃度對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響

2.3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)產(chǎn)酶的影響

當(dāng)菌體培養(yǎng)時(shí)間分別達(dá)到 2、3、4、5、6、7、8h 時(shí)，添加終濃度為10mmol/L的乳糖作為誘導(dǎo)劑。由圖3可知，當(dāng)菌體培養(yǎng)6h，即菌體密度達(dá)到OD600=0.7左右時(shí)，進(jìn)行誘導(dǎo)所得的酶活最高。這是由于培養(yǎng)時(shí)間較短，菌體生物量會(huì)偏低，產(chǎn)酶能力較差;培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌體則可能進(jìn)入衰退階段，產(chǎn)生自溶現(xiàn)象，嚴(yán)重影響產(chǎn)酶。

圖3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響

2.4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

菌體培養(yǎng)6h后加入終濃度為10mmol/L的乳糖，誘導(dǎo)時(shí)間分別為 1、2、4、6、8、10、20、22、24、26h。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到20h時(shí)所產(chǎn)酶酶活最高(圖4)。但考慮到工業(yè)生產(chǎn)的績(jī)效，我們選擇誘導(dǎo)時(shí)間為6h，此時(shí)所得酶活較誘導(dǎo)20h的低10.39%，但發(fā)酵時(shí)間縮短了70%，可以明顯加快發(fā)酵產(chǎn)酶速度，提高效率，增大產(chǎn)量。

圖4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響

2.5 誘導(dǎo)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

溫度是影響菌體生長(zhǎng)和表達(dá)的重要因素。由于菌種的最適生長(zhǎng)溫度和最適表達(dá)溫度不同，因此在不同階段應(yīng)該選擇不同的溫度，采用變溫發(fā)酵方式［16］。

菌體在37℃培養(yǎng)6h后，添加終濃度為10mmol/L的乳糖，同時(shí)將溫度分別調(diào)節(jié)到 31、33、35、37、39、41、43℃，誘導(dǎo)6h。結(jié)果顯示，當(dāng)誘導(dǎo)階段的溫度達(dá)到41℃時(shí)所產(chǎn)酶酶活最高(圖5)。誘導(dǎo)溫度低于35℃時(shí)，對(duì)酶活的負(fù)面影響顯著，可能是由于低溫會(huì)使?fàn)I養(yǎng)物的攝入和生長(zhǎng)速率降低，攝氧速度降低。在41℃以上繼續(xù)升溫，卻不再表現(xiàn)出提高酶活的作用，這是因?yàn)楦邷仉m有利于提高生物量，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率較高，但代謝副產(chǎn)物乙酸積累也隨之增加，同時(shí)高溫會(huì)使蛋白產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊、變性等，從而降低了酶活。

圖5 誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響

2.6 優(yōu)化前后菌體產(chǎn)酶的比較

分別采用優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件和初始條件同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，圖6是對(duì)蛋白表達(dá)的SDS－PAGE檢測(cè)，在標(biāo)準(zhǔn)蛋白66200Da下方的條帶為目的蛋白的表達(dá)條帶(65100Da)。結(jié)果顯示，隨著乳糖誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，目的蛋白的表達(dá)量也有所提高，均高于IPTG作為誘導(dǎo)劑時(shí)的表達(dá)量。證明采用優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件進(jìn)行發(fā)酵，不僅有效地提高了酶活，也提高了目的蛋白的表達(dá)。

圖6 優(yōu)化前后目的蛋白的表達(dá)

2.7 酶學(xué)特性的研究

2.7.1 β－葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度 將底物溶液分別在30、40、50、60、70、80、90℃水浴中保溫 10min，常規(guī)方法測(cè)定酶活。以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖，得到該酶的最適反應(yīng)溫度。結(jié)果如圖7所示，隨著溫度的升高酶活逐漸上升，最適反應(yīng)溫度為 70℃，溫度繼續(xù)升高，酶活會(huì)顯著下降，在80℃酶活僅有77.6%。

2.7.2 β－葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性 將待測(cè)酶液分別在40、50、60、70、80℃水浴中保溫，每隔 10min 取樣，立即冰浴，常規(guī)方法測(cè)定酶活。以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖，得到溫度對(duì)酶活的影響曲線(xiàn)。結(jié)果如圖8所示，β－葡聚糖酶在70℃以下，穩(wěn)定性較好，保溫1h酶活最多損失不超過(guò)40%，70℃穩(wěn)定性最高，保溫0.5h內(nèi)損失不超過(guò)10%，在80℃僅20min酶活殘存已不足20%。

圖7 β－葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度

圖8 β－葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性

2.7.3 β－葡聚糖酶的最適反應(yīng)pH 配制pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5 的底物溶液，常規(guī)方法測(cè)定酶活。以pH為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖，得到pH對(duì)酶活的影響曲線(xiàn)。結(jié)果如圖9所示，β－葡聚糖酶在pH5.6～7.0之間，酶活相差不大，基本都維持在80%左右，較為穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH為7.6，當(dāng)pH＞7.6，隨著堿性升高，酶活不斷下降。

圖9 β－葡聚糖酶的最適反應(yīng)pH

2.7.4 β－葡聚糖酶的pH穩(wěn)定性 分別用pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0 的緩沖液配制酶溶液，室溫保溫1h，常規(guī)方法測(cè)定酶活。以pH為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力的百分比為縱坐標(biāo)作圖，得到酶的pH穩(wěn)定曲線(xiàn)。結(jié)果如圖10所示，β－葡聚糖酶在pH6～8之間，酶活都能維持在80%以上，穩(wěn)定性范圍較寬，pH＜6時(shí)酶活顯著下降，pH為7時(shí)最穩(wěn)定。

圖10 β－葡聚糖酶的pH穩(wěn)定性

2.7.5 金屬離子對(duì)β－葡聚糖酶的影響 用不同金屬離子與酶液混合，常規(guī)方法測(cè)定酶活。以未添加任何鹽類(lèi)的酶活為100%，結(jié)果顯示，Ca2+和Fe3+對(duì)β－葡聚糖酶的活性有一定的激活作用，Mg2+、Zn2+、Cu2+、K+、Na+和Fe2+對(duì)β－葡聚糖酶的活性具有抑制作用。

3 結(jié)論

IPTG是β－半乳糖苷酶底物的類(lèi)似物，有很強(qiáng)的誘導(dǎo)力。在有IPTG誘導(dǎo)物存在的情況下，誘導(dǎo)物可與阻遏蛋白形成復(fù)合物使其構(gòu)象發(fā)生改變，致使阻遏蛋白不能與O基因結(jié)合，從而促進(jìn)基因表達(dá)。但I(xiàn)PTG價(jià)格昂貴，具有潛在的毒性，因此大多用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模表達(dá)。

乳糖是一種新近出現(xiàn)的誘導(dǎo)劑，鑒于其低廉無(wú)毒的特性，正在逐漸替代IPTG成為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的誘導(dǎo)劑。它與IPTG誘導(dǎo)機(jī)理的最大差異在于［17］:IPTG可以直接進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)部且不會(huì)被細(xì)菌代謝，但乳糖只能在β－半乳糖苷透過(guò)酶的作用下進(jìn)入細(xì)胞，且需要β－半乳糖苷酶轉(zhuǎn)化發(fā)揮作用。因此進(jìn)行乳糖誘導(dǎo)基因工程菌生長(zhǎng)和表達(dá)條件的研究是十分必要的。

本研究比較了IPTG和α－乳糖兩種誘導(dǎo)劑發(fā)酵重組大腸桿菌產(chǎn)β－葡聚糖酶的效果，結(jié)果顯示以乳糖作為誘導(dǎo)劑，不僅可以顯著提高酶活，也可以提高菌體目的蛋白的表達(dá)量，因此可以替代IPTG作為表達(dá)β－葡聚糖酶的誘導(dǎo)劑。在深入研究乳糖作為誘導(dǎo)劑時(shí)其濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間等因素對(duì)菌株生長(zhǎng)和目的蛋白表達(dá)的影響后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)重組大腸桿菌培養(yǎng)6h(OD600達(dá)到0.7左右)后，加入終濃度為10mmol/L的α－乳糖，升溫至41℃，誘導(dǎo)6h，可達(dá)到的最大酶活為830.7U/mL，較初始以IPTG為誘導(dǎo)劑的情況，酶活提高2倍左右，且發(fā)酵周期縮短了70%，在誘導(dǎo)效果和效率方面都顯示了其極大的優(yōu)勢(shì)。

以該重組菌種為來(lái)源菌種所產(chǎn)的β－葡聚糖酶pH穩(wěn)定范圍較寬，熱穩(wěn)定性良好，在生理溫度(70℃左右)下活性高，摒棄了以往工程菌的缺陷，具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］韓晶，李寶坤，李開(kāi)雄，等.β－葡聚糖酶的特性與應(yīng)用研究［J］.中國(guó)釀造，2008(17):4－7.

［2］鄒東恢，江潔.β－葡聚糖酶的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2005(8):7－9.

［3］華衛(wèi)東，徐子偉.β－葡聚糖酶在豬的大麥基礎(chǔ)日糧中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.飼料研究，1999(5):18－21.

［4］李永仙，鄭飛云，李崎，等.重組大腸桿菌 BL2l(DE3)－pET28a(+)－bgl誘導(dǎo)表達(dá) β－葡聚糖酶的條件優(yōu)化［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，28(2):250－255.

［5］李青青，陳啟和，蔣孝燕，等.基因工程菌EGs2產(chǎn)β－葡聚糖酶條件優(yōu)化及產(chǎn)酶特性［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，15(4):708－712.

［6］Borriss R，Olsen O，Thomsen KK，et al.Hybrid Bacillus endo－(1－3，1－4)－β－glucanases:construction of recombinant genes and molecular properties of the gene product［J］.Carlsberg Res Commun，1989，54:41－54.

［7］Tang Xingjun，He Guoqing，Chen Qihe，et al.Medium optimization for the production of thermal stable β－glucanase by Bacillus subtilis ZJF－1A5 using response surface methodology［J］.Bio resource Technology，2004，93:175－181.

［8］周世寧.現(xiàn)代微生物生物技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2007:208.

［9］Yi－ Ping Weng，F(xiàn)ang－ Ciao Hsu，Wun－ Syue Yang，et al.Optimization of the overexpression of glutamate mutase component under the control of T7 system by using lactose and IPTG as the inducers［J］.Enzyme and Microbial Technology，2006，38:465－469.

［10］Michael Kotik，Marcela Kocanová，Helena Maresová，et al.High－level expression of a fungal pyranose oxidase in high celldensity fed－batch cultivations of Escherichia coli using lactose as inducer［J］.Protein Expression and Purification，2004，36:61－69.

［11］Santosh O.Ramchuran，Olle Holst，Eva Nordberg Karlsson.Effect of postinduction nutrient feed composition and use of lactose as inducer during production of thermostable xylanase in Escherichia coli glucose－ limited fed－ batch cultivations［J］.Journal ofBioscienceandBioengineering，2005，99(5):477－484.

［12］李兆鵬，張栩，徐斌，等.重組大腸桿菌高密度發(fā)酵中乳糖誘導(dǎo)表達(dá) hBLyS［J］.過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2005，5(4):446－449.

［13］王宏華，凌紅麗，馬向東，等.乳糖誘導(dǎo)重組雞γ干擾素基因在大腸桿菌中的表達(dá)［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2008，25(6):25－27.

［14］褚仲梅，申秀云，劉現(xiàn)杰，等.以乳糖為誘導(dǎo)劑的高密度發(fā)酵［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2001，32(11):491－493.

［15］楊瑞，王淑秀，陳正躍，等.提高基因工程中重組蛋白質(zhì)表達(dá)效率及可溶性產(chǎn)物的一種新方法［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2006，29(10):92－93.

［16］林俊涵.畢赤酵母高密度發(fā)酵工藝的研究［J］.中國(guó)生物工程雜志，2009，29(5):120－125.

［17］吳一凡，張雙全，高秀玉，等.乳糖誘導(dǎo)pET載體表達(dá)重組蛋白的研究［J］.南京師大學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2002，25(1):89－93.

Expression and characteristic of β－Glucanase in Escherichia coli induced by lactose

DAI Yi－xing，WANG Hong－xin，LV Wen－ping*，SUN Jun－tao，QIN Xiao－juan

(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The feasibility of expression of β－Glucanase in recombinant E.coli BL21 induced by lactose instead of IPTG was studied.The main factors of induction such as terminal concentration of lactose，the optimal time of induction，the duration and temperature of induction were analyzed.The results showed that the optimal condition was to add 10mmol/L(terminal concentration)lactose when the cell density achieved to OD6000.7，changed the temperature from 37℃ to 41℃ and induce 6h.The maximum enzyme activity of 830.7U/mL induced by lactose was higher 2 times than IPTG，and the period of fermentation shortened 70%.The enzyme was stable at pH6～8，and thermal stability，as well as high activity at the physiological temperature(about 70℃).The research demonstrated that lactose could be used as an efficient inducer of genetically engineered strain.

genetically engineered strain;β－Glucanase;lactose;IPTG;enzyme characteristic

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)09－0206－04

2010－12－06 *通訊聯(lián)系人

戴易興(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品功能因子開(kāi)發(fā)。

無(wú)錫市科技創(chuàng)業(yè)計(jì)劃(CIE00920);國(guó)家自然科學(xué)基金(20090964)。