李洪濤,粟永萍△,徐建明,冉新澤,王軍平,艾國(guó)平,程天民

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院全軍復(fù)合傷研究所,創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400038;2.Dept.of Molecular and Cellular Biology,Baylor College of Medicine,77030 Houston USA)

干擾素誘導(dǎo)蛋白IFIT1的克隆與原核可溶性表達(dá)＊

李洪濤1,粟永萍1△,徐建明2,冉新澤1,王軍平1,艾國(guó)平1,程天民1

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院全軍復(fù)合傷研究所,創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400038;2.Dept.of Molecular and Cellular Biology,Baylor College of Medicine,77030 Houston USA)

目的 研究干擾素誘導(dǎo)蛋白IFIT1的原核可溶性表達(dá)。方法 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲得IFIT1編碼序列,克隆入原核表達(dá)載體,電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌,篩選陽(yáng)性克隆,誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá),蛋白凝膠電泳觀察。結(jié)果 構(gòu)建的原核表達(dá)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了較豐富的麥芽糖結(jié)合蛋白融合IFIT1(MBP-IFIT1)可溶性表達(dá)。結(jié)論 MBP-IFIT1的原核可溶性表達(dá)為后續(xù)IFIT1蛋白結(jié)合分析及免疫分析提供了材料及方法學(xué)基礎(chǔ)。

創(chuàng)傷和損傷;細(xì)胞應(yīng)激;重組;原核表達(dá)

IFIT1(interferon induced factor with tetratricopeptide repeats-1,IFIT1)受Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)迅速合成,且含有多個(gè)串聯(lián)排列的 TPR模體(tetratricopeptide repeats motif),所以得名[1]。IFIT1分子中的 TPR模體為34個(gè)簡(jiǎn)并氨基酸構(gòu)成的重復(fù)結(jié)構(gòu),具有介導(dǎo)蛋白分子間結(jié)合及蛋白復(fù)合物組配的作用[2]。相關(guān)的研究報(bào)道 IFIT1借其 TPR模體,通過(guò)結(jié)合細(xì)胞內(nèi)靶蛋白,發(fā)揮生物效應(yīng)[3-6];作者前期的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)IFIT1可能與糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)結(jié)合,參與調(diào)節(jié) GR的轉(zhuǎn)錄活性[7];為進(jìn)一步研究 IFIT1的功能,本文進(jìn)行了鼠源細(xì)胞株 IFIT1 cDNA全長(zhǎng)編碼序列的克隆、其原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組融合蛋白可溶性原核表達(dá)的實(shí)驗(yàn),報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、菌株與質(zhì)粒 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株 RAW264.7(ATCC TIB-71)、菌株 E.coli BL21(DE3)、原核表達(dá)質(zhì)粒p GEX-4T-1為作者所保存,原核表達(dá)質(zhì)粒pMAL-C2X為New England Biolab(NEB)公司產(chǎn)品。

1.2 試劑 細(xì)胞固體培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)自 Hyclone公司,細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、IPTG購(gòu)自 Sigma公司,RNA抽提試劑(Tripure isolation reagent)購(gòu)自Roche,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒 ——RNA LA PCR kit、限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ、BamHⅠ及 T4連接酶購(gòu)自 Takara公司,質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)-mega Bio-tech,引物委托 Takara公司合成,酵母提取物和胰蛋白胨為Oxiod公司產(chǎn)品。

1.3 自鼠源性細(xì)胞株逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增IFIT1編碼序列 DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清,5%CO2,37℃培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,至80%細(xì)胞匯合時(shí),向培養(yǎng)基中加入LPS,至終濃度0.1 μg/mL,以誘導(dǎo)IFIT1的轉(zhuǎn)錄[10],刺激6 h后收獲細(xì)胞。提取細(xì)胞總RNA,即向培養(yǎng)細(xì)胞中直接加入RNA抽提試劑,裂解細(xì)胞,加入定量氯仿,漩渦振蕩,室溫靜置,12 000 r/min離心15min,取上層水相,加入定量異丙醇,低溫12 000 r/min離心15min,收集沉淀的RNA,75%的乙醇洗滌,50μL RNase free dH2O溶解RNA,在紫外分光光度儀測(cè)RNA濃度。按Takara RNA PCR kit的說(shuō)明,進(jìn)行 RT-PCR操作,先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系:4μL MgCl2,2μL 10×RNA buffer,8.5μL RNase free dH2O,2μL dNTP Mixture,0.5μL RNase Inhibitor,1μL AMV reverse transcriptase,1μL Oligo dT(15 mers),0.1μg total RNA,20μL total volume。反應(yīng)條件:30 ℃10min,50℃50min,99℃5min。然后,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與6μL MgCl2,8μL 10×PCR buffer,0.5μL Takara pyrobest Taq,1.0μM IFIT1引物,61.5μL dH2O混合,組成100μL反應(yīng)體系。進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng),擴(kuò)增IFIT1全長(zhǎng)編碼序列(coding sequence,CDS)。PCR反應(yīng)條件:94℃2min(1個(gè)循環(huán)),94℃30 s,63℃50 s,72℃1.5min(35個(gè)循環(huán))。0.8%的瓊脂糖凝膠水平電泳顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。IFIT1引物序列:引物1:5′CGG AAT TCA TGG GAG AGA ATG CTG ATG GTG AC3′;引物 2:5′CGG GAT CCT CAG AAT GCA GGG TTC ATT TCC CC3′(斜體部分為引入的側(cè)翼堿基,下劃線部分為引入的限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ、BamHⅠ位點(diǎn))。

1.4 小鼠IFIT1克隆入原核表達(dá)載體pMAL-C2X 參照O-mega Bio-tech的操作流程,純化 PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增、抽提pMAL-C2X質(zhì)粒。對(duì)兩者同時(shí)進(jìn)行 EcoRⅠ、BamHⅠ的雙酶切反應(yīng)。產(chǎn)物以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳回收IFIT1及載體片斷。按1∶3的摩爾比混合載體片斷與插入片斷,以 T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀,去除溶液中離子。然后電穿孔,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化菌株接種于氨芐青霉素抗性的培養(yǎng)板,次日挑取克隆,混懸于10μL雙蒸水中,取1μL菌液,以其煮沸裂解后產(chǎn)生的質(zhì)粒DNA為模板,摻入引物1和引物2進(jìn)行 PCR反應(yīng),篩選重組子轉(zhuǎn)化克隆。擴(kuò)增、提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA,進(jìn)行 EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切鑒定,并進(jìn)行插入片段的測(cè)序。

1.5 陽(yáng)性克隆的誘導(dǎo)表達(dá) 配制氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基,并加入葡萄糖至終濃度0.2%,抑制背景表達(dá)。挑取pMAL-C2X-IFIT1轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)單菌落,37℃250 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取1 mL培養(yǎng)物,接種于50 mL培養(yǎng)基中,37℃250 r/min振蕩培養(yǎng)8 h,至OD6000.4時(shí),向培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度0.3 mM,30℃250 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h,誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。隨即4℃5 000 g離心10min收集菌體,PBS洗滌,超聲破碎,進(jìn)行 SDS-PAGE分析。

2 結(jié) 果

2.1 IFIT1的擴(kuò)增、載體構(gòu)建及陽(yáng)性克隆的鑒定 小鼠IFIT1全長(zhǎng)編碼序列自起始密碼子ATG至終止密碼子U GA,共1 392 bp。提取經(jīng)LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株RAW264.7的總 RNA,采用具有3′→5′外切酶活性的耐熱DNA聚合酶,進(jìn)行高保真的 RT-PCR反應(yīng),得到了全長(zhǎng)編碼序列產(chǎn)物(圖1)。通過(guò)限制性酶切→連接反應(yīng),IFIT1 CDS定向克隆于原核融合表達(dá)質(zhì)粒pMAL-C2X中,形成原核融合表達(dá)載體pMALC2X-IFIT1(圖2),其中擔(dān)體——麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein,MBP)融合于IFIT1分子的N端。連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21(DE3),挑取7個(gè)單菌落,以引物1、引物2進(jìn)行PCR反應(yīng),篩選出2個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化陽(yáng)性克隆(圖3)。將其擴(kuò)增,抽提質(zhì)粒,進(jìn)一步以限制性酶切反應(yīng)鑒定(圖4),單酶切反應(yīng)產(chǎn)物較pMAL-C2X空載體(6.64 kb)增加了約1 kb,雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)2個(gè)條帶,分別對(duì)應(yīng)線性化pMAL-C2X空載體及插入片斷IFIT1 CDS,初步證實(shí)成功構(gòu)建了IFIT1融合表達(dá)質(zhì)粒pMAL-C2X-IFIT1。進(jìn)一步對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鹼基測(cè)序,結(jié)果與 Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中小鼠 IFIT1 cDNA的序列信息100%吻合。

2.2 重組蛋白的原核可溶性表達(dá) 通過(guò)觀察誘導(dǎo)時(shí)間(2～6 h),誘導(dǎo)溫度(25 ℃～37 ℃),IPTG濃度(0.05～1 mM);等不同的誘導(dǎo)條件下融合蛋白MBP-IFIT1的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)0.3 mM的IPTG,30℃誘導(dǎo)6 h可獲得較好的可溶性表達(dá)(圖5),此時(shí)可溶性表達(dá)與細(xì)菌包涵體內(nèi)折疊蛋白(圖5)比例接近1∶1。繼續(xù)降低溫度及 IPTG濃度并不增加可溶性蛋白的比例,反而降低目的蛋白MBP-IFIT1總的表達(dá)量,進(jìn)而降低可溶性蛋白的產(chǎn)量。

圖1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RT-PCR的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 原核表達(dá)載體pMAL-C2X-IFIT1的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

圖3 瓊脂糖凝膠電泳顯示菌落PCR方法篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化克隆的結(jié)果

圖4 轉(zhuǎn)化陽(yáng)性克隆的限制性酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖5 蛋白凝膠電泳分析轉(zhuǎn)化大腸桿菌中MBP-IFIT1的表達(dá)情況

3 討 論

相關(guān)的研究報(bào)道IFIT1因病毒感染及旁分泌的干擾素的誘導(dǎo)而表達(dá),進(jìn)而結(jié)合并干擾了真核細(xì)胞翻譯起始因子的活性,因而抑制病毒顆粒的組裝,是真核細(xì)胞一種內(nèi)在的抵御病毒感染的途徑[3-4]。但 IFIT1并非只因病毒而激活,Wathelet等[5]以細(xì)菌LPS刺激3T3細(xì)胞,也獲得了 IFIT1的迅速高表達(dá)。白細(xì)胞介素-1、視黃酸同樣可誘導(dǎo)細(xì)胞高表達(dá) IFIT1[6]。而本文觀察到實(shí)驗(yàn)性嚴(yán)重創(chuàng)傷早期 IFIT1的表達(dá)也迅速升高[8]。在燒傷早期小鼠中,IFIT1在肝、脾、肺臟等的轉(zhuǎn)錄迅速激活,mRNA及蛋白分子水平在正常對(duì)照小鼠很低或不能檢出,傷后則明顯提高,并持續(xù)數(shù)天至1周;顱腦沖擊傷小鼠傷后早期的多臟器觀察中,也發(fā)現(xiàn)IFIT1 mRNA水平的類似變化。嚴(yán)重創(chuàng)傷繼發(fā)炎癥反應(yīng),細(xì)胞暴露于高炎性介質(zhì)刺激下,IFIT1此時(shí)的迅速表達(dá),表明高炎性介質(zhì)應(yīng)激,也可誘導(dǎo) IFIT1表達(dá)[9-14]。預(yù)示IFIT1不僅是病毒感染應(yīng)激分子;除抵御病毒感染機(jī)制外,該分子可能具有其他的功能。

為進(jìn)行IFIT1的功能研究,作者首先希望得到IFIT1的可溶性分子,籍此進(jìn)行親和分子的篩選,借IFIT1結(jié)合靶蛋白功能的指向,尋找進(jìn)一步功能研究的線索。對(duì)于細(xì)菌而言,重組質(zhì)粒編碼蛋白為外源性蛋白,雖然在細(xì)菌內(nèi)能正確編碼,但能否正確折疊而形成可溶性功能蛋白,常不能事先預(yù)料,一旦不能正確形成二、三級(jí)結(jié)構(gòu),疏水基團(tuán)外露即會(huì)凝聚沉淀,而形成細(xì)菌包涵體。作者前期構(gòu)建了以 GST作為擔(dān)體的原核融合表達(dá)質(zhì)粒p GEX-4T-IFIT1,盡管實(shí)現(xiàn)了重組融合蛋白 GST-IFIT1的原核表達(dá),但幾乎均為包涵體蛋白(結(jié)果未列出),沒(méi)有可溶性蛋白出現(xiàn),無(wú)法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究。隨后改用MBP作為擔(dān)體,構(gòu)建原核融合表達(dá)質(zhì)粒pMAL-C2X-IFIT1,結(jié)果表明原核表達(dá)的重組蛋白MBP-IFIT1,不僅有可溶性表達(dá),而且表達(dá)量豐富,接近總量的50%,因此,利于親和純化,用作抗原,制備針對(duì)天然蛋白的高特異性抗體[15],進(jìn)行 IFIT1的免疫分析等。進(jìn)一步以其為誘餌,體外篩選結(jié)合靶分子,根據(jù)結(jié)合靶分子探明IFIT1的功能。

重組分子——麥芽糖結(jié)合蛋白融合 IFIT1(MBP-IFIT1)在適當(dāng)誘導(dǎo)條件下可實(shí)現(xiàn)較豐富的原核可溶性表達(dá),為進(jìn)一步的蛋白結(jié)合分析及免疫分析提供了材料及方法學(xué)基礎(chǔ)。

[1]Wathelet M,Moutschen S,Defilippi P,et al.Molecular cloning,full-length sequence and preliminary characterization of a 56-kDa protein induced by human interferons[J].Eur J Biochem,1986,155(1):11-17.

[2]Sikorski RS,Boguski MS,Goebl M,et al.A repeating amino acid motif in CDC23 defines a family of proteins and a new relationship among genes required for mitosis and RNA synthesis[J].Cell,1990,60:307-317.

[3]Sen GC.Novel functions of interferon-induced proteins[J].Semin Cancer Biol,2000,10(2):93-101.

[4]Smith JB,Herschman HR.The glucocorticoid attenuated response genesGARG-16,GARG-39,andGARG-49/IRG2 encode inducible proteins containing multiple tetratricopeptide repeat domains[J].Arch Biochem Biophys,1996,330(2):290-300.

[5]Wathelet MG,Clauss IM,Nols CB,et al.New inducers revealed by the promoter sequence analysis of two interferon-activated human genes[J].Eur J Biochem,1987,169(2):313-321.

[6]Ye S,Pang H,Gu YY,et al.Protein interaction for an interferon-inducible systemic lupus associated gene,IFIT1[J].Rheumatology,2003,42(10):1155-1163.

[7]Li SR,Su YP,Liu XH,et al.The interferon induced protein P56 interact with glucocorticoid receptor and regulate GR transcriptional activity[J].Prog Biochem Biophys,2004,31(9):791-795.

[8]李洪濤,粟永萍,徐建明,等.燒傷小鼠 IFIT1表達(dá)的初步觀察[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(22):2250-2252.

[9]李淑蓉,粟永萍,鄧正陽(yáng),等.燒傷小鼠早期 P56與 IFN mRNA表達(dá)變化及麻醉或 KPV對(duì)其表達(dá)的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,30(5):367-369.

[10]鄧正陽(yáng),李淑蓉,王蒙,等.人 P56蛋白及其各種缺失突變體酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,26(7):561-564.

[11]任泂,粟永萍,李洪濤,等.JAB1表達(dá)下調(diào)對(duì)LPS誘導(dǎo)炎性因子 TNF-α和IL-26的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,29(16):1552-1554.

[12]陸建華,陶軍,葉建寧,等.頸交感神經(jīng)阻滯對(duì)放燒復(fù)合傷小鼠HPA軸的調(diào)節(jié)及相關(guān)機(jī)制研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(21):2111-2113.

[13]王明海,粟永萍,程天民,等.糖皮質(zhì)激素受體基因RNA干擾的生物學(xué)效應(yīng)研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,26(20):1795-1798.

[14]Li HT,Su YP,Cheng TM,et al.The interaction between interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats-1 and eukaryotic elongation factor-1A[J].Mol Cell Biochem,2010,337:101-110.

[15]郭曉姝,李洪濤,方海立,等.小鼠 IFIT1多克隆抗體的制備[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,29(15):1462-1464.

Cloning and soluble prokaryotic expression of IFIT1＊

L i Hongtao1,Su Yongping1△,Xu J ianming2,Ran Xinze1,Wang J unping1,Ai Guoping1,Cheng Tianming1
(1.State Key L aboratory ofTrauma,B urns and Combined Injury,Institute of Combined Injury,College ofPreventive Medicine,Third Military Medical University,Chongqing,400038,China;2.Dept.of Molecular and Cellular Biology,Baylor College of Medicine,Houston,TX77030,U.S.A.)

Objective To investigate the soluble prokaryotic expession of interferon induced factor with tetratricopeptide repeats-1.Methods By reverse transcription PCR,murine IFIT1 cDNA coding sequence was acquired,and cloned into the prokaryotic expression vector.Then the E.coli was transformed by electroporation with the recombinant.The screened positive cloning was induced to express target recombining protein which was observed with SDS-PAGE.Results The aplenty soluble fusion proteins MBP-IFIT1 could be obtained by this prokaryotic expression construction.Conclusion Accomplishment of the soluble expression of MBP-IFIT1 provides basements of the IFIT1 follow-up functional studies.

wounds and injuries;cell-stress;recombinants;prokaryotic expression

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.19.001

A

1671-8348(2011)19-1873-03

國(guó)家973創(chuàng)傷項(xiàng)目05課題基金資助項(xiàng)目(2005CB522605);海外青年學(xué)者合作研究基金資助項(xiàng)目(30328025)?！?/p>

,Tel:13608393962;E-mail:suyp2003@yahoo.com.cn。

2011-01-09

2011-03-15)