鄒立強(qiáng)，劉 偉，劉軍平，劉成梅

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047)

MPEG-SS修飾對(duì)DHPM去折疊胰蛋白酶相對(duì)活性、熱穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

鄒立強(qiáng)，劉 偉*，劉軍平，劉成梅

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047)

采用ω－琥珀酰酯酸琥珀酰亞胺酯活化的α－甲氧基－聚乙二醇(mPEG－SS)，修飾經(jīng)動(dòng)態(tài)高壓微射流(Dynamic high－pressure microfluidization，DHPM)誘導(dǎo)的去折疊態(tài)(unfolding)胰蛋白酶，研究經(jīng)mPEG－SS修飾后其相對(duì)活性、熱穩(wěn)定性、動(dòng)力學(xué)(米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速率Vmax)變化情況。結(jié)果表明:經(jīng)mPEG－SS修飾后，天然態(tài)和去折疊態(tài)胰蛋白酶的相對(duì)活性都沒有明顯改變;修飾后去折疊胰蛋白酶(DTP)較天然胰蛋白酶(NTP)的耐熱性有明顯提高，當(dāng)溫度為55、45℃條件下保溫180min，NTP和DTP的相對(duì)活性分別提高了2%、7%和19%、30%;經(jīng)mPEG－SS修飾后天然胰蛋白酶和去折疊胰蛋白酶的Km分別為4.67、3.24mg/mL，Vmax分別為0.042、0.034U/min，均比未經(jīng)修飾的要小。修飾后去折疊胰蛋白酶(DTP)的Km比天然胰蛋白酶(NTP)小，表明修飾后去折疊胰蛋白酶比修飾后天然胰蛋白酶具有更強(qiáng)的與底物(酪蛋白)的親和能力。

胰蛋白酶，mPEG－SS，相對(duì)活性，熱穩(wěn)定性，動(dòng)力學(xué)參數(shù)

胰蛋白酶是一種堿性蛋白水解酶，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、輕工等方面，天然胰蛋白酶的熱不穩(wěn)定性導(dǎo)致在工業(yè)應(yīng)用中表現(xiàn)活性下降甚至失活。采用酶改性手段來(lái)提高胰蛋白酶活性或改善其熱穩(wěn)定性成為近年來(lái)酶學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。酶改性手段主要有:a.化學(xué)修飾手段，如Pilpel等［1］采用二硫蘇糖醇處理胰蛋白酶極大地提高了其活性，Zhang等［2］和Treetharnmathurot等［3］采用聚乙二醇修飾胰蛋白酶以改善其生物活性和熱穩(wěn)定性;b.固定化手段，如Liu等［4］采用固定化手段將胰蛋白酶固定于亞油酸修飾的殼聚糖載體上以改善其反應(yīng)穩(wěn)定性，Andrzej等［5］研究了陰離子交換樹脂固定胰蛋白酶的催化活性; c.物理手段，如Vercet等［6］采用超聲波和熱處理相結(jié)合的方法研究胰蛋白酶的活性與穩(wěn)定性影響，Dufour等［7］和Maynard等［8］報(bào)道了靜高壓(High hydrostatic pressure，HHP)誘導(dǎo)胰蛋白酶的活性變化。本課題組采用動(dòng)態(tài)高壓微射流(Dynamic high－pressure microfluidization，DHPM)誘導(dǎo)的去折疊態(tài)(unfolded)胰蛋白酶，其熱穩(wěn)定性和 pH穩(wěn)定性有極大的提高［9］。由于胰蛋白酶的去折疊態(tài)是一種不穩(wěn)定狀態(tài)，出于其能量最低化的趨勢(shì)牽引或者其本身最低分子勢(shì)能作用下，通常會(huì)自發(fā)地進(jìn)行再折疊，或自身聚集，或與其它分子發(fā)生反應(yīng)而聚集，在一定的時(shí)間內(nèi)要么可逆回到天然態(tài)，要么重新演化形變到一種新的平衡穩(wěn)定態(tài)。為穩(wěn)定胰蛋白酶的去折疊態(tài)，采用聚乙二醇修飾是共價(jià)化學(xué)修飾的經(jīng)典方法。早在1965年Badran在Nature雜志上就介紹了PEG共價(jià)化學(xué)修飾表面氨基酸是改變蛋白質(zhì)(酶)性質(zhì)的一種有力的輔助手段［10］;Bailon等［11］進(jìn)一步報(bào)道了PEG可與蛋白質(zhì)(酶)表面的氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)(酶)的生物活性或穩(wěn)定性;Roberts等［12］總結(jié)了PEG能與各種氨基酸以及N端和C端的羧基發(fā)生反應(yīng)。已有研究報(bào)道，Gaertner等［13］和Zhang等［14］報(bào)道了天然胰蛋白酶經(jīng)PEG修飾后其活性和熱穩(wěn)定性的影響。本文以動(dòng)態(tài)高壓微射流誘導(dǎo)的去折疊態(tài)胰蛋白酶為對(duì)象，采用ω－琥珀酰酯酸琥珀酰亞胺酯活化的α－甲氧基－聚乙二醇(mPEG－SS)為分子補(bǔ)丁，修飾天然胰蛋白酶和DHPM誘導(dǎo)的去折疊態(tài)胰蛋白酶，測(cè)定mPEG－SS修飾前后其相對(duì)活性、熱穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km、Vmax)，并比較修飾后天然胰蛋白酶和去折疊態(tài)胰蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)之間的差異，為進(jìn)一步研究胰蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)的調(diào)控技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胰蛋白酶(產(chǎn)品編號(hào)0785－1G) 美國(guó)Amresco公司;mPEG－SS(5kDa KZ－MO5SS－101209) 北京凱正生物工程發(fā)展有限責(zé)任公司;酪蛋白(AR) 廣州齊云生物技術(shù)有限公司;三氯乙酸(AR) 天津市大茂化學(xué)試劑廠;Tris(AR) 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;鹽酸等 均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

PC－1600紫外光譜儀 上海美譜達(dá)公司; M－110EH30超高壓微射流均質(zhì)機(jī) 美國(guó)Microfluidics公司;Delta 320 pH計(jì) 上海梅特勒－托力多儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TGL－16C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DHPM誘導(dǎo)天然胰蛋白酶溶液的去折疊 參照文獻(xiàn)［9］的方法，配制濃度為1.0mg/mL的胰蛋白酶溶液，采用M－110EH30超高壓微射流均質(zhì)機(jī)在90MPa下處理3次，獲得去折疊態(tài)胰蛋白酶溶液。

1.2.2 mPEG－SS修飾胰蛋白酶溶液 參照文獻(xiàn)［15］的方法。mPEG－SS溶液以5∶1的摩爾比加入到1.0mg/mL的天然胰蛋白酶和去折疊胰蛋白酶溶液中。mPEG－SS胰蛋白酶混合溶液在室溫條件下用磁力攪拌器攪拌1h，然后在4℃下用透析袋透析48h進(jìn)行純化，凍干;對(duì)照組用緩沖液代替mPEG－SS，其它條件與實(shí)驗(yàn)組相同。天然胰蛋白酶、去折疊胰蛋白酶、經(jīng)mPEG－SS修飾后的天然和去折疊態(tài)胰蛋白酶樣品組分別簡(jiǎn)寫為NT、DT、NTP、DTP。

1.2.3 胰蛋白酶活性的測(cè)定 以酪蛋白為反應(yīng)底物，參照文獻(xiàn)［16］的方法測(cè)定胰蛋白酶的活性。以Tris－HCl緩沖液(pH 8.0)配制胰蛋白酶溶液(NT、DT、NTP、DTP)，取1mL胰蛋白酶溶液(NT、DT、NTP、DTP)加入2mL Tris－HCl緩沖液(pH8.0)在37℃下預(yù)熱 10min，再加入 5mL 37℃下預(yù)熱好的酪蛋白(2mg/mL)，混勻，反應(yīng)30min，加入5mL 5%三氯乙酸終止反應(yīng)，將上述溶液于10000r/min條件下離心10min，在277nm下測(cè)定其吸光度。

酶活力單位的定義:每分鐘增加1.0吸光度定義為一個(gè)活力單位(U)。

相對(duì)酶活性的定義:

1.2.4 胰蛋白酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定 以Tris－HCl緩沖液(pH 8.0)配制胰蛋白酶溶液(NT、DT、NTP、DTP)，分別在25、35、45、55、65℃保溫30min，迅速冷卻至室溫，然后根據(jù)1.2.3方法測(cè)定活性。

將配制好的胰蛋白酶溶液(NT、DT、NTP、DTP)在45℃保溫180min，每隔30min取出適量的酶液，迅速冷卻至室溫，然后根據(jù)1.2.3方法測(cè)定活性。

1.2.5 胰蛋白酶動(dòng)力學(xué)參數(shù) Km、Vmax的測(cè)定 按1.2.3方法測(cè)定在不同濃度的酪蛋白溶液中胰蛋白酶的反應(yīng)速率，然后采用Lineweaver－Burk作圖法計(jì)算出胰蛋白酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析及處理 每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，取平均值。采用SAS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 mPEG－SS修飾對(duì)胰蛋白酶相對(duì)活性的影響

天然胰蛋白酶經(jīng)過(guò)90MPa DHPM處理后其相對(duì)活性為97%，這與本課題組前期報(bào)道相一致［9］。經(jīng)mPEG－SS修飾后，天然胰蛋白酶和去折疊態(tài)胰蛋白酶其相對(duì)活性變化不大，分別為102%、96%。Zhang等［14］報(bào)道了經(jīng)過(guò)分子量為350、750u的mPEG修飾后的胰蛋白酶催化底物Nα－苯甲酰－DL－精氨酸對(duì)硝基苯酰胺鹽酸鹽(BAPNA)的活性分別下降至原酶的80%、85%，而經(jīng)過(guò)分子量為2000、5000u的mPEG修飾后，其相對(duì)活性分別升高至原酶的 140%、150%。Hubert等［17］采用分子量為 350、550、750、2000、5000、8000、10000u的PEG對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行了修飾，其催化底物BAPNA的相對(duì)活性分別為原酶的3.56、4.17、3.89、3.55、3.64、2.93、1.66倍，而其催化底物N－苯甲酰－L－精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)的相對(duì)活性卻分別為原酶的 1.54、1.45、1.45、1.54、1.54、1.27、1.27倍，這說(shuō)明不同底物對(duì)PEG修飾胰蛋白酶的活性影響很大。

2.2 mPEG－SS修飾對(duì)胰蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響

不同溫度下的胰蛋白酶的相對(duì)活性變化情況，如圖1所示，當(dāng)反應(yīng)溫度為25、35℃時(shí)，NT、NTP、DT、DTP相對(duì)活性比較接近。當(dāng)反應(yīng)溫度為45℃時(shí)，NT、NTP相對(duì)活性急劇下降分別為65%、70%，而DT、DTP相對(duì)活性保持較高的穩(wěn)定性，分別為100%、102%，參照J(rèn)ongh等［18］和Stupishina等［19］的分析，這可能是因?yàn)镈HPM處理使胰蛋白酶內(nèi)部的氫鍵發(fā)生了變化，胰蛋白酶分子轉(zhuǎn)化成較為穩(wěn)定的水合狀態(tài);當(dāng)反應(yīng)溫度升至55℃時(shí)，DTP相對(duì)活性比DT高出19%，而此時(shí)NTP相對(duì)活性比NT僅高出2%，表明經(jīng)mPEG－SS修飾后去折疊胰蛋白酶具有較好的耐熱穩(wěn)定性，而天然胰蛋白酶經(jīng)mPEG－SS修飾后其耐熱穩(wěn)定性并沒有顯著的提高;當(dāng)溫度繼續(xù)升至65℃時(shí)，NT、NTP、DT、DTP都降低到45%以下，這主要是高溫影響胰蛋白酶的弱鍵(主要是氫鍵)，改變了胰蛋白酶的構(gòu)象，從而使其活性下降;DT、DTP的相對(duì)活性比NT、NTP的活性分別低了30%、17%，這可能是因?yàn)镈HPM去折疊胰蛋白酶處于亞穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)去折疊胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)更容易被破壞，從而活性下降更多。

圖1 不同溫度對(duì)胰蛋白酶相對(duì)活性的影響

在45℃溫度下不同保溫時(shí)間胰蛋白酶的相對(duì)活性的變化情況，如圖2所示，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，NT和DT相對(duì)活性都逐漸降低，但是DT的相對(duì)活性比NT高，當(dāng)處理時(shí)間為180min時(shí)，DT的相對(duì)活性為64%，而NT僅為32%，表明DHPM處理能提高胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性。NTP與NT的相對(duì)活性比較接近，表明mPEG－SS修飾并不能提高天然胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性。隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，DT相對(duì)活性下降的比較快，而DTP然仍保持在94%之上，表明mPEG－SS的修飾增強(qiáng)了去折疊態(tài)胰蛋白酶的穩(wěn)定性。

圖2 不同時(shí)間對(duì)胰蛋白酶相對(duì)活性的影響

2.3 mPEG－SS修飾對(duì)胰蛋白酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

以酪蛋白為反應(yīng)底物測(cè)定了NT、NTP、DT、DTP反應(yīng)速率隨底物濃度的變化關(guān)系圖(見圖3)。采用Line weaver－Burk作圖法，求出了NT、NTP、DT、DTP的 Km，Vmax值分別為 6.21、4.67、4.05、3.24mg/mL，0.053、0.042、0.040、0.034U/min。經(jīng)過(guò)DHPM處理，DT的Km、Vmax值分別為NT的65.2%、75.5%，表明去折疊胰蛋白酶與酪蛋白親和能力增強(qiáng)了。天然胰蛋白酶經(jīng)過(guò)mPEG－SS修飾，其Km、Vmax值分別為NT的75.2%、79.2%，這表明mPEG－SS修飾也能提高胰蛋白酶與酪蛋白親和能力。Hubert等［17］發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)分子量350、550、750、5000、8000u的PEG修飾的胰蛋白酶的 Km分別為 0.68、0.62、0.46、0.41、0.42、0.49、0.37mmol/L，均比天然胰蛋白酶的 0.80都要低。DHPM去折疊處理胰蛋白酶經(jīng)mPEG－SS修飾，其Km、Vmax值分別為 DT的 80.0%、85.0%，這表明mPEG－SS修飾也能提高去折疊胰蛋白酶與酪蛋白的親和能力。但是DTP的Km值比NTP要低的多，這表明DTP與酪蛋白的親和能力高于NTP。

圖3 底物濃度對(duì)胰蛋白酶相對(duì)活性的影響

3 結(jié)論

經(jīng)mPEG－SS修飾對(duì)天然胰蛋白酶和動(dòng)態(tài)高壓微射流誘導(dǎo)去折疊態(tài)胰蛋白酶相對(duì)活性影響不大;雖然天然胰蛋白酶經(jīng)mPEG－SS修飾后，其耐熱性也沒有明顯的提高，但是DHPM去折疊態(tài)胰蛋白酶經(jīng)mPEG－SS修飾后，其耐熱性有顯著的提高，在溫度為55℃下的相對(duì)活性及在45℃下保溫180min的相對(duì)活性均在87%之上。經(jīng)mPEG－SS修飾后，天然胰蛋白酶和去折疊胰蛋白酶的 Km、Vmax都比未經(jīng)mPEG－SS修飾的要小，但DTP的Km比NTP小，表明修飾后的DHPM誘導(dǎo)的去折疊態(tài)胰蛋白酶與反應(yīng)底物(酪蛋白)的親和能力高于修飾后的天然胰蛋白酶。

［1］PILPEL N，NEZER I，Applebaum S W，et al.Matingincreases trypsin in female Drosophila hemolymph［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2008，38(3):320－330.

［2］ZHANG Ziding，HE Zhimin，HE Mingxia.Stabilization mechanism ofMPEG modified trypsin based on thermal inactivation kinetic analysis and molecular modeling computation［J］.Journal of Molecular Catalysis B－Enzymatic，2001，14 (4－6):85－94.

［3］TREETHAMMATHUROTB，OVARTLARNPORNC，Wungsintaweekul J，et al.Effect of PEG molecular weight and linking chemistry on the biological activity and thermal stability of PEGylated trypsin［J］.International Journal of Pharmaceutics，2008，357(1－2):252－259.

［4］LIU Chenguang，DESAI K G H，CHEN Xiguang，et al. Preparation and characterization ofnanoparticles containing trypsin based on hydrophobically modified chitosan［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53(5):1728－1733.

［5］JARZEBSKI A B，SZYMANSKA K，BRYJAK J，et al.Covalent immobilization of trypsin on to siliceous mesostructured cellular foams to obtain effective biocatalysts［J］.Catalysis Today，2007，124(1－2):2－10.

［6］Vercet A，Burgos J，Crelier S，et al.Inactivation of proteases and lipases by ultrasound［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2001，2(2):139－150.

［7］DUFOUR E，HERVE G，HAERTLE T.Hydrolysis of Beta－Lactoglobulin by Thermolysin and Pepsin under High Hydrostatic－Pressure［J］.Biopolymers，1995，35(5):475－483.

［8］MAYNARD F，WEINGAND A，HAU J，et al.Effect of highpressure treatment on the tryptic hydrolysis of bovine betalactoglobulin AB［J］.International Dairy Journal，1998，8(2): 125－133.

［9］LIU Wei，ZHANG Zhaoqin，LIU Chengmei，et al.The effect of dynamic high－pressure microfluidization on the activity，stability and conformation of trypsin［J］.Food Chemistry，2010，123(3): 616－621.

［10］BADRAN A M，JONES D E.Polyethylene glycols－tannins interaction in extracting enzymes［J］.Nature，1965，206:622－624.

［11］BAILON P，BERTHOLD W.Polyethylene glycol－conjugated pharmaceutical proteins［J］.Pharmaceutical Science＆Technology Today，1998，1(8):352－356.

［12］ROBERTS M J，BENTLEY M D，HARRIS J M.Chemistry for peptide and protein PEGylation［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2002，54(4):459－476.

［13］GAERTNER H F，PUIGSERVER A J.Increased Activity and Stability of Poly(Ethylene Glycol)－Modified Trypsin［J］.Enzyme and Microbial Technology，1992，14(2):150－155.

［14］ZHANG Ziding，HE Zhimin，GUAN Guoqiang.Thermal stability and thermodynamic analysis of native and methoxypolyethylene glycol modified trypsin［J］.Biotechnology Techniques，1999，13(11):781－786.

［15］FERNANDEZ M，F(xiàn)RAGOSO A，CAO R，et al.Chemical conjugation of trypsin with monoamine derivatives of cyclodextrins－Catalytic and stability properties［J］.Enzyme and Microbial Technology，2002，31(4):543－548.

［16］PURCENA L L A，CARAMORI S S，Mitidieri S，et al.The immobilization of trypsin onto polyaniline for protein digestion［J］.MaterialsScience＆ EngineeringC－Biomimeticand Supramolecular Systems，2009，29(4):1077－1081.

［17］GAERTNER H F，PUIGSERVER A J.Increased Activity and Stability of Poly(Ethylene Glycol)－Modified Trypsin［J］.Enzyme and Microbial Technology，1992，14(2):150－155.

［18］DEJONGH H H J，GOORMAGHTIGH E，RUYSSCHAERT J M.Monitoring structural stability of trypsin inhibitor atthe submolecular level by amide－proton exchange using Fourier transform infrared spectroscopy:A test case for more general application［J］.Biochemistry，1997，36:13593－13602.

［19］STUPISHINA E A，KHAMIDULLIN R N，Vylegzhanina N N，et al.Ethylene glycol and the thermostability of trypsin in a reverse micelle system［J］.Biochemistry－Moscow，2006，71(5): 533－537.

Effect of mPEG－SS modification on relative activity，thermal stability and kinetic parameters of DHPM unfolding trypsin

DHPM unfolding trypsin was modified by mPEG－SS.The relative activity，thermal stability and kinetic parameters(Km，Vmax)of trypsin were measured.Results showed that mPEG－SS modification did not change the relative activities of native and DHPM unfolding trypsin.mPEG－SS modification enhanced the thermal stability of unfolded trypsin more obviously than native trypsin.When incubated at 55℃or incubated at 45℃180min，the values of mPEG－SS modification enhancing the relative activity of native and unfolded trypsin were 2%，7%and 19%，30%respectively.The Kmand Vmaxof native and unfolded trypsin modified by mPEG－SS were 4.67，3.24mg/mL and 0.042，0.034U/min respectively，which were lower than native and unfolded trypsin.The Kmof unfolded trypsin modified by mPEG－SS was lower than native trypsin modified by mPEG－SS，which meant that the former would affine casein easier than later.

trypsin;mPEG－SS;relative activity;thermal stability;kinetic parameters

ZOU Li－qiang，LIU Wei*，LIU Jun－ping，LIU Cheng－mei

(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

TS201.2

A

1002－0306(2011)12－0103－04

2011－08－31 *通訊聯(lián)系人

鄒立強(qiáng)(1987－)，男，在讀碩士研究生，研究方向:食物(含生物質(zhì))資源的開發(fā)與利用。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060209);國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)青年骨干研究基金(SKLF－QN－201101)。