陳麗艷，金 爽，張 迎，李 月，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)研究院，黑龍江哈爾濱150036)

猴頭菌發(fā)酵刺五加后多糖與紫丁香苷的含量變化研究

陳麗艷，金 爽，張 迎，李 月，王偉明*

(黑龍江省中醫(yī)研究院，黑龍江哈爾濱150036)

研究猴頭菌發(fā)酵刺五加后多糖及紫丁香苷的含量變化，為新藥源開發(fā)提供理論依據(jù)。以蒽酮-硫酸法測定猴頭菌發(fā)酵刺五加前后多糖的含量，并采用高效液相色譜法對發(fā)酵前后紫丁香苷的含量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，猴頭菌發(fā)酵刺五加后多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由發(fā)酵前的0.3%提高到0.7%，多糖的含量提高了133%;而刺五加原藥材中紫丁香苷的含量為0.0096%，發(fā)酵后在紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)峰對應(yīng)處未出峰，而是在其它位置出現(xiàn)了三個(gè)新的譜帶。猴頭菌發(fā)酵刺五加后多糖含量顯著提高，可以起到協(xié)同或增加猴頭菌及刺五加藥效的作用;發(fā)酵物中紫丁香苷成分未檢出，是由于發(fā)酵后紫丁香苷在微生物酶的作用下降解轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)，有利于提高生物利用度，為新藥源的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

猴頭菌，刺五加，發(fā)酵，多糖，紫丁香苷

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)品 購于中國藥品生物制品檢定所，批號111574-200502，規(guī)格20mg;葡萄糖對照品購于中國藥品生物制品檢定所，批號110833-200503;其他試劑 均為色譜純或分析純;猴頭菌 購于黑龍江省微生物研究所，菌種名稱猴頭菌(Hericium erinaceus)，編號8415;刺五加 購于黑龍江省藥材公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)研究院付克志研究員鑒定為Acanthopanax senticosus(Rupr.etMaxim.)Harms。

UV2550紫外-可見分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠;KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器郁良公司;FA1104分析天平 上海天平儀器廠;KE·WEI電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永新實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠;PH140A型培養(yǎng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;YS-280B手提式不銹鋼蒸汽消毒器 上海三申醫(yī)療器械有限公司;AF-20A密封型搖擺式中藥粉碎機(jī) 溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司;SSI型高效液相色譜儀 天津市蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司;Diamonsil C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm) 中國迪馬公司。

1.2 發(fā)酵菌質(zhì)的制備

以猴頭菌為發(fā)酵菌種，CPDA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)傳代，以刺五加為藥性基質(zhì)加入麩皮15%，碳酸鈣1%，硫酸鈣1%及藥材總重1.5倍體積的蒸餾水浸泡12h作為發(fā)酵培養(yǎng)基。傳代后的菌液接種于高壓滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)40d。發(fā)酵好的藥性菌質(zhì)先自然干燥，再于40℃烘干，粉碎備用。

1.3 多糖含量測定

1.3.1 樣品多糖提取 取刺五加原藥材及刺五加發(fā)酵樣品各100g，按照固液比1∶10的比例加水于80℃水浴浸提兩次，每次4h，合并濾液并濃縮至100mL，冷卻后加乙醇至濃度為30%，靜置過夜，真空抽濾，棄去濾渣。濾液加乙醇至濃度為80%，操作同上，用無水乙醇沖洗濾渣至粉末狀，干燥至恒重，即為多糖。

1.3.2 刺五加未加菌發(fā)酵培養(yǎng)基對照樣品的多糖提取 刺五加中加入1.5倍體積蒸餾水浸泡12h，并加入麩皮15%，碳酸鈣1%，硫酸鈣1%，滅菌后不接種猴頭菌，在相同條件下進(jìn)行發(fā)酵處理，作為對照，同樣稱取100g，同法提取多糖。

1.3.3 蒽酮硫酸法方法學(xué)考察

1.3.3.1 線性關(guān)系考察 精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖對照品20mg，加蒸餾水溶解定容至100mL，配成0.2g/L的葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)液。再精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液1、2、3、4、5mL置于10mL容量瓶中，以蒸餾水定容搖勻，得系列對照品溶液。稱取0.2g蒽酮，加100mL濃硫酸，置于棕色瓶中，混合搖勻置于冰箱中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

精密吸取上述系列對照品溶液1.0mL，置于10mL具塞試管中，將試管置于冰水中，分別向試管中加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4mL，待各管加完后同時(shí)搖勻，沸水浴中準(zhǔn)確加熱10min，取出用冷水迅速冷卻至室溫，放置10min，于620nm處測定吸光度。另精密吸取蒸餾水1.0mL，同法操作，作為空白對照。以吸光度值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 精密度、重現(xiàn)性、顯色穩(wěn)定性和加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取葡萄糖對照品溶液，連續(xù)測定5次，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn);精密稱取同批樣品粉末5份，按照樣品中多糖提取步驟提取樣品溶液，精密吸取樣品溶液各1.0mL，分別置于10mL具塞試管中，進(jìn)行重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn);精密吸取制得的某一樣品溶液1.0mL，分別在顯色后0、10、20、40、60、80、100、120min測定吸光度，進(jìn)行顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn);精密稱取已知含量的同批5份樣品，精密加入一定量的葡萄糖對照品，進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率。

1.3.4 多糖含量測定

1.3.4.1 樣品溶液制備 分別取刺五加原藥材，刺五加發(fā)酵物及刺五加未加菌發(fā)酵培養(yǎng)基對照提取的3種多糖樣品各12mg，精密稱定，加蒸餾水定容至100mL量瓶中，以蒽酮-硫酸法［9］測定含量，實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.3.4.2 多糖含量測定 精密吸取1.3.4.1制得的樣品溶液各1.0mL于具塞試管中，按1.3.3的方法測定吸光度，由回歸方程計(jì)算供試液中葡萄糖濃度。多糖含量(%)=CD/W×100%

其中:C:樣品溶液中葡萄糖的濃度(g/L);D:樣品溶液的稀釋倍數(shù);W:樣品重量(g)。

1.4 紫丁香苷含量的測定［10－11］

1.4.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(4.6mm× 250mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈-水(10∶90);柱溫:室溫;紫外檢測波長265nm，流速0.08mL/min，進(jìn)樣量10μL。

1.4.2 對照品溶液制備 精密稱取紫丁香苷1mg置于10mL容量瓶中，以甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻得濃度0.10g/L紫丁香苷對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液制備 分別精密稱取刺五加原藥材，刺五加發(fā)酵物，刺五加未加菌發(fā)酵培養(yǎng)基對照及麩皮15%、碳酸鈣1%、硫酸鈣1%混合物的粉末各約2g，精密加入甲醇20mL，稱重，記錄重量，浸12h后，超聲處理(250kw，36kHz)30min，靜置至室溫，補(bǔ)足重量，過濾后取續(xù)濾液備用。

1.4.4 方法學(xué)考察

1.4.4.1 線性關(guān)系考察 取紫丁香苷對照品溶液(0.10g/L)。分別精密吸取對照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5mL溶于10mL容量瓶中，分別進(jìn)樣10μL。按上述色譜條件測定峰面積。以紫丁香苷進(jìn)樣量Y為縱坐標(biāo)、峰面積X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4.2 精密度、重復(fù)性和回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取紫丁香苷對照品溶液(0.10g/L)10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定紫丁香苷峰面積，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn);取刺五加原藥材樣品溶液，平行5次取樣，制備供試品溶液，進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn);采取加樣回收法，取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)(含紫丁香苷為0.096mg/g)刺五加原藥材樣品約1.0g，精密加入紫丁香苷對照品溶液(0.10g/L) 1.0mL，制備供試品溶液，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖含量測定

2.1.1 方法學(xué)考察 如圖1所示，在20～100μg范圍內(nèi)葡萄糖的含量與吸光度呈良好線性關(guān)系。且本方法精密度和重現(xiàn)性良好，RSD值分別為0.67%和2.67%。顯色穩(wěn)定性結(jié)果顯示該樣品在20～120min內(nèi)吸收值基本穩(wěn)定。平均回收率為97.52%，RSD為2.55%，回收率較好。各項(xiàng)結(jié)果均表明本方法可行。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 多糖含量測定結(jié)果 刺五加原藥材、刺五加發(fā)酵物及刺五加未加菌發(fā)酵培養(yǎng)基對照提取的3種多糖樣品含量測定結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示刺五加經(jīng)猴頭菌發(fā)酵后多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由原藥材的0.30%提高到0.70%，刺五加未加菌發(fā)酵培養(yǎng)基對照中，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.39%，發(fā)酵后多糖的含量提高了133%。

圖2 刺五加發(fā)酵前后多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

猴頭菌發(fā)酵刺五加后多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，一方面由于刺五加屬木質(zhì)類，經(jīng)發(fā)酵后猴頭菌產(chǎn)生的酶系能夠使木質(zhì)素和纖維素等刺五加細(xì)胞壁組成成分降解，產(chǎn)生大量多糖;另一方面猴頭菌在刺五加藥性基質(zhì)生長旺盛時(shí)也會產(chǎn)生大量的多糖。

2.2 紫丁香苷含量測定

2.2.1 方法學(xué)考察 經(jīng)計(jì)算得回歸方程為Y= 5.09535×107X-0.312986，r=0.9997，表明紫丁香苷在0.05～0.25μg與峰面積具有良好的線性關(guān)系。且精密度、重復(fù)性良好，RSD值分別為1.18%和1.90%，平均回收率為98.54%，RSD 2.12%(n=5)，表明此方法可行，能夠滿足定量分析的要求。

2.2.2 紫丁香苷含量測定結(jié)果 在確定的色譜條件下，分別測定刺五加原藥材，刺五加發(fā)酵物，刺五加未加菌發(fā)酵培養(yǎng)基對照及麩皮、碳酸鈣、硫酸鈣混合物中紫丁香苷含量，進(jìn)樣量10μL。由表1可知，刺五加原藥材紫丁香苷含量0.0096%，刺五加發(fā)酵后紫丁香苷未檢出，刺五加未加菌發(fā)酵培養(yǎng)基對照紫丁香苷含量0.0025%，麩皮、碳酸鈣、硫酸鈣混合物中紫丁香苷峰譜對應(yīng)處沒有干擾;如圖3所示。

將刺五加發(fā)酵前后HPLC圖按保留時(shí)間分為a(0～5min)，b(5～10min)，c(10～15min)，d(15～20min)，e(20～25min)五個(gè)保留時(shí)間區(qū)。由表2可見，a1、a2、a3、a4、b2在刺五加未加菌發(fā)酵培養(yǎng)基對照(C)及麩皮、碳酸鈣、硫酸鈣混合物(D)中均出現(xiàn)，說明這四條譜帶為來自麩皮、碳酸鈣、硫酸鈣的混合物;刺五加發(fā)酵物(B)中a4、b3、d1三條譜帶全部消失，而產(chǎn)生了a5、b5、e1三條新譜帶。

表2 刺五加發(fā)酵前后HPLC出峰的結(jié)果

圖3 刺五加發(fā)酵前后HPLC圖

表1 紫丁香苷含量檢測結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

刺五加經(jīng)猴頭菌發(fā)酵后多糖的含量顯著提高，有利于提高其生物活性及利用度;刺五加中的紫丁香苷被猴頭菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化后，含量顯著減少，表明已被猴頭菌分解轉(zhuǎn)化。發(fā)酵后的高效液相圖譜中新生成了三條新譜帶，這三種物質(zhì)將進(jìn)一步通過液質(zhì)聯(lián)用及核磁技術(shù)進(jìn)行檢測。

［1］張晶，劉芳芳，陳彥池，等.刺五加化學(xué)成分及藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國野生植物資源，2008，27(3):6-10.

［2］徐萌萌，王建芳，徐春，等.微生物轉(zhuǎn)化苷類中藥的機(jī)理及應(yīng)用［J］.世界科學(xué)技術(shù)，2006，24(8):2-6.

［3］葛喜珍.發(fā)酵在中藥研究中的應(yīng)用［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19(10):386-387.

［4］吳志勇.發(fā)酵中藥-現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)中藥配方的結(jié)合［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2003，2(12):22-25.

［5］Lin QY，Jin LJ，Cao ZH，et al.Inhibition of induciblenitric oxide synthase by Acanthopanax senticosus extract in RAW264.7 macrophages［J］.J Ethnopharmacol，2008，118(14):231-236.

［6］Yamada M，Tanabe F，Arai N，et al.Bioavailability of glucosyl hesperidins in rats［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2006，70 (11):1386-1394.

［7］Demain AL，Adrio JL.Contributions of microorganisms to industrial biology［J］.Mol Biotechnol，2008，38(10):41-45.

［8］莊毅，池玉梅，陳慎寶，等.藥用真菌新型固體發(fā)酵工程與槐芪菌質(zhì)的研制［J］.中國藥學(xué)雜志，2004，39(3):175-176.

［9］王黎明，夏文水.蒽酮-硫酸法測定茶多糖含量的研究［J］.食品科學(xué)，2005，26(7):185-188.

［10］劉建華，呂寧，文娟.高效液相色譜法測定刺五加中丁香苷的含量［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17(4):960-962.

［11］李辰，王曉燕，胡緒瑋，等.刺五加抗疲勞活性部位中刺五加苷B的含量測定［J］.中國中藥雜志，2008，33(23):2801 -2802.

The content analysis of the crude polysaccharides and syringin in Acanthopanax senticosus fermented by Hericium erinaceus

CHEN Li-yan，JIN Shuang，ZHANG Ying，LI Yue，WANG Wei-ming*
(Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150036，China)

To study the content of the crude polysaccharides and syringin in Acanthopanax senticosus fermented by Hericium erinaceus，and it would be offer the theoretical basis for developing the new resources of Traditional Chinese Medicine.The content of the crude polysaccharides and syringin in Acanthopanax senticosus before and after fermentation were determined by anthrone-sulphuric acid and HPLC methods，respectively.The results showed that the mass percentage of crude polysaccharides in the raw material was 0.3%，and it rose to 0.7%after fermented.The content of syringin in the raw material was 0.0096%，the peak was disappeared at the same retention time of syringin after fermented，and three new peaks were found.The content of crude polysaccharides in the fermented products of Acanthopanax senticosus was increased significantly，and the pharmacological effect may be stronger than before;syringin was disappeared in the fermented products of Acanthopanax senticosus，the reason may be that syringin has been transformed to other components with the efforts of microbiology enzymes. It was propitious to raise bioavailability and establishes a research foundation for the new Traditional Chinese Medicine resource development in the future.

Acanthopanax senticosus;Hericium erinaceus;fermentation;polysaccharides;syringin

TS201.3

A

1002-0306(2011)09-0184-04

猴頭菌(Hericium erinaceus)隸屬于擔(dān)子菌門、猴頭菌科，為藥食兼用真菌，具有助消化、降血糖及抗氧化等藥理活性，其有效成分為多糖。刺五加為五加科，五加屬植物刺五加 Acanthopanax senticosus (Rupr.etMaxim.)Harms的干燥根莖［1］，具有提高免疫力、抗疲勞、抗腫瘤等藥理活性，其有效成分為多糖和苷類［2］。雙向發(fā)酵技術(shù)使藥物經(jīng)體外微生物大量酶系分解轉(zhuǎn)化［3-4］，可提高藥效及有效成分提取率，產(chǎn)生新藥效，并為藥物活性成分結(jié)構(gòu)修飾提供了新途徑［5-7］。研究采用雙向發(fā)酵技術(shù)［8］，用猴頭菌發(fā)酵中藥刺五加，實(shí)現(xiàn)苷類成分在體外轉(zhuǎn)化為苷元，以利于人體吸收;多糖含量提高有利于藥效的增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對發(fā)酵物中紫丁香苷含量進(jìn)行對比分析，并利用蒽酮-硫酸法對其多糖含量進(jìn)行檢測。

2010-09-14 *通訊聯(lián)系人

陳麗艷(1971-)，女，副主任藥師，從事中藥研究及開發(fā)。

十一五國家科技支撐計(jì)劃(2006BAI06A20-11)。