陶樹興，蘇 蕊，薛 靜，田澤英，叢 寅，柴 霞

（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

蜂蜜酒生香酵母產(chǎn)酯性能比較和產(chǎn)酯條件研究

陶樹興，蘇 蕊，薛 靜，田澤英，叢 寅，柴 霞

（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

對(duì)6株生香酵母在蜂蜜酒發(fā)酵中的產(chǎn)酯性能進(jìn)行比較，探討生香酵母的產(chǎn)酯條件，為蜂蜜酒的發(fā)酵提供參考。結(jié)果表明，異常漢遜酵母異常變種（Hansenula anomala var.anomala）1437產(chǎn)酯最高，為0.8431 g/L；該菌株產(chǎn)酯開始時(shí)的乙醇濃度以5%～6%比較合適，最適pH為5，最適溫度為25～28℃，裝液量以40%～50%較好，連續(xù)振蕩不利于產(chǎn)酯；接種生香酵母2d后再接入1%釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）1306能促進(jìn)異常漢遜酵母異常變種1437產(chǎn)酯。

蜂蜜酒，生香酵母，總酯，產(chǎn)酯條件

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

異常漢遜酵母異常變種（Hansenula anomala var. anomala）1437、1427、1312，異常畢赤酵母（Pichiaanomala）1851，伯頓擬內(nèi)孢霉（Endomycopsis burtonii）31347，季也蒙假絲酵母季也蒙變種（Candida guilliermondii var.guilliermondii）1274，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）197、1306 均由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）提供；釀酒活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；荊條蜜 由山西沁花蜂業(yè)有限公司提供；酵母膏 生化試劑；葡萄糖、磷酸氫二銨、磷酸二氫鉀、氯化鎂、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、次甲基藍(lán)、氫氧化鈉、濃硫酸、對(duì)二甲氨基苯甲醛、鄰苯二甲酸氫鉀、乙醇、無水碳酸鈉、溴甲酚綠、甲基紅 均為分析純?cè)噭?；異丁醇、異戊?為色譜試劑；斜面種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖50g，酵母膏2g，KH2PO40.2g，（NH4）2HPO40.5g，瓊脂20g，10%豆芽汁1000mL，pH自然；液體種子培養(yǎng)基（g/L） 蜂蜜70g，酵母膏2g， KH2PO40.2g，（NH4）2HPO40.5g，MgCl20.1g，10%豆芽汁1000mL，pH自然；蜂蜜酒發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 蜂蜜230g（還原糖161g），酵母膏0.1g，KH2PO40.1g，（NH4）2HPO40.25g，MgCl20.1g，5%豆芽汁1000mL，pH5。

立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-D恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LRH-250A生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；U-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；SL電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；水蒸氣蒸餾裝置，全玻璃蒸餾器，酒精計(jì)，全玻璃回流裝置，回流瓶，酸式滴定管，堿式滴定管等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子制備 將生香酵母菌種1437、1427、1312、31347、1851、1274接于斜面種子培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3d。將斜面菌種用5mL液體培養(yǎng)基洗下，再轉(zhuǎn)入50mL液體種子培養(yǎng)基中，28℃，160r/min振蕩培養(yǎng)24h得液體種子。

1.2.2 蜂蜜酒發(fā)酵 在500mL的三角瓶中裝入200mL蜂蜜酒發(fā)酵培養(yǎng)基，分別接入生香酵母種子液20mL，用聚丙烯薄膜封口，28℃培養(yǎng)10d，使酒精度達(dá)到5%左右；然后用8層紗布替換聚丙烯薄膜，28℃培養(yǎng)10d，完成產(chǎn)酯過程；發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酒精度、還原糖、總酯、總酸和雜醇油。乙醇含量對(duì)產(chǎn)酯的影響、裝液量及振蕩對(duì)產(chǎn)酯的影響是直接在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加乙醇后，進(jìn)行產(chǎn)酯發(fā)酵。

1.3 分析方法

依據(jù)GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[9]，酒精度測(cè)定用酒精計(jì)法；還原糖用菲林試劑直接滴定法；總酸測(cè)定用指示劑法。依據(jù)GB/T 10345-2007《白酒分析方法》，用指示劑法測(cè)定總酯[10]。雜醇油測(cè)定用二甲氨基苯甲醛比色法[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，均值比較采用Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蜂蜜酒發(fā)酵中生香酵母產(chǎn)酯性能比較

6株生香酵母分別發(fā)酵產(chǎn)酯。發(fā)酵結(jié)束后，酒精度、殘?zhí)恰⒖傰?、總酸、雜醇油含量和感官特征的測(cè)定結(jié)果列于表1。

由表1可以看出，異常漢遜酵母異常變種1437總酯含量最高，為0.8431g/L；季也蒙假絲酵母季也蒙變種1274發(fā)酵液總酯含量最低，為0.2051g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，1437與其它5個(gè)菌株之間的總酯含量有顯著差異（P＜0.05）。1437酒精度為4.77%（V/V），還原糖為10.20g/L；異常漢遜酵母異常變種1427酒精度為4.56%（V/V），還原糖為10.29g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，1437和1427與其他4個(gè)菌株之間的酒精度及還原糖有顯著差異（P＜0.05）。

1274總酸含量最高，為3.030g/L，1427總酸含量最低，為2.413g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示,不同菌株之間的總酸含量有顯著差異（P＜0.05）。1437雜醇油含量最低，為0.079g/L；1274雜醇油含量最高，為0.101g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示,不同菌株之間的雜醇油含量有顯著差異（P＜0.05）。

蜂蜜酒中的酯類物質(zhì)主要是乙酸乙酯，是生香酵母在醇?；D(zhuǎn)移酶AATas的作用下生成酯酰輔酶A，再由酯酶催化醇和酯酰輔酶A化合生成酯[12]。酵母菌種是影響蜂蜜酒中酯含量的首要因素，不同菌種細(xì)胞內(nèi)酯酰輔酶A的活性和產(chǎn)生量均不相同，生成酯的能力也不相同[13]。

雜醇油是在釀造酒的過程中,由蛋白質(zhì)、氨基酸以及糖類化合物分解而成的具有強(qiáng)烈氣味的高級(jí)醇類，主要包括丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、戊醇、異戊醇、己醇和庚醇等[14]。雜醇油是白酒中醇甜和助香劑的主要物質(zhì)，也是形成香味物質(zhì)的前驅(qū)物質(zhì)，含量過多會(huì)導(dǎo)致酒辛辣，苦澀。高級(jí)醇在人體內(nèi)氧化速度慢，停留時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)引起頭痛，神經(jīng)系統(tǒng)充血等癥狀[15]。國(guó)標(biāo)規(guī)定白酒中雜醇油的含量為≤0.20g/100mL（以異丁醇、異戊醇計(jì)）。

蜂蜜酒中的總酸是蜂蜜原汁酸和酵母菌代謝酸的總和[16]。適量的酸能使酒體醇厚爽口，平衡酒中苦味。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，異常漢遜酵母異常變種1437總酯含量及酒精度最高，酸度適中，雜醇油含量最少，口感好，適用于蜂蜜酒的發(fā)酵產(chǎn)酯實(shí)驗(yàn)。

2.2 蜂蜜酒發(fā)酵中乙醇含量對(duì)生香酵母產(chǎn)酯的影響

蜂蜜酒發(fā)酵培養(yǎng)基中添加無水乙醇，使乙醇含量依次為3%、4%、5%、6%、7%，然后進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酯。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酒精度、殘?zhí)?、總酯、總酸、雜醇油，結(jié)果見表2。

由表2可知，乙醇含量5%～6%時(shí)總酯含量最高，分別為0.8172、0.8069g/L；乙醇含量3%時(shí)總酯含量最低，為0.6207g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，乙醇含量5%～6%與其他濃度之間的總酯有顯著差異（P＜0.05）。乙醇含量5%時(shí)酒精度最高，為6.607%（V/ V）；3%時(shí)酒精度最低，為6.460%（V/V）。方差分析顯示，不同乙醇含量之間的酒精度無顯著差異（P＞0.05）。乙醇含量7%時(shí)殘?zhí)呛孔罡?，?7.09g/L；3%時(shí)殘?zhí)呛孔畹停瑸?6.03g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，不同乙醇含量之間的殘?zhí)呛坑酗@著差異（P<0.05）。

表1 蜂蜜酒發(fā)酵中生香酵母的產(chǎn)酯性能比較

表2 乙醇含量對(duì)蜂蜜酒發(fā)酵中生香酵母產(chǎn)酯的影響

表3 pH對(duì)蜂蜜酒發(fā)酵中生香酵母產(chǎn)酯的影響

表4 溫度對(duì)蜂蜜酒發(fā)酵中生香酵母產(chǎn)酯的影響

乙醇含量3%時(shí)總酸含量最高，為3.066g/L；7%時(shí)總酸含量最低，為2.560g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示,不同乙醇含量之間的總酸含量有顯著差異（P<0.05）。乙醇含量3%時(shí)雜醇油含量最高，為0.111g/L；7%時(shí)雜醇油含量最低，為0.071g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，不同乙醇含量之間的雜醇油含量有顯著差異（P<0.05）。

可見添加適量的乙醇有利于生香酵母產(chǎn)酯，其中以加入5%的乙醇時(shí)產(chǎn)酯效果最好，但添加乙醇過量將會(huì)對(duì)生香酵母產(chǎn)酯產(chǎn)生抑制作用。

2.3 蜂蜜酒發(fā)酵中pH對(duì)生香酵母產(chǎn)酯的影響

用乙酸將發(fā)酵液pH分別調(diào)至3、3.5、4、4.5、5、5.5、6進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酒精度、殘?zhí)?、總酯、總酸、雜醇油，結(jié)果見表3。

由表3可知，pH 5時(shí)總酯含量最高，為0.8069g/L；pH3時(shí)總酯含量最低，為0.5917g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，pH5與其它pH之間的總酯有顯著差異（P<0.05）。pH5時(shí)酒精度最高，為4.4%（V/V），還原糖為11.02g/L；pH 5.5時(shí)，酒精度為4.34%（V/V），還原糖為11.05g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示, pH5~5.5與其它pH之間的酒精度、還原糖有顯著差異（P<0.05）。

pH6和pH5.5時(shí)總酸含量最高，均為3.242g/L；pH3.5時(shí)總酸含量最低，為2.608g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示,不同pH之間的總酸含量有顯著差異（P<0.05）。pH3時(shí)雜醇油含量最高，為0.119g/L；pH6時(shí)雜醇油含量最低，為0.053g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示,不同pH之間的雜醇油含量有顯著差異（P<0.05）。

以往研究表明，在pH5.0~5.5或偏酸性環(huán)境中生長(zhǎng)的酵母，其活性和酒精耐受性高，有利于乙醇的積累，發(fā)酵酒精能力好。而pH≥7.6，即偏堿性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)生的中間產(chǎn)物乙醛不能正常作為受氫體，而在兩分子乙醛之間發(fā)生歧化反應(yīng),相互氧化還原，生成甘油和等量的乙醇和乙酸，減少乙醇的產(chǎn)量。發(fā)酵液的pH對(duì)酯酶亦產(chǎn)生影響，當(dāng)pH為4.5~6.5時(shí)有利于酯酶催化酯的合成，pH＞7.5或pH＜4.5時(shí)酯酶就會(huì)分解酯[16]。本次實(shí)驗(yàn)中，pH=5時(shí)，測(cè)定總酯含量顯著高于其它處理組，與以往的研究結(jié)果相一致。

2.4 蜂蜜酒發(fā)酵中溫度對(duì)生香酵母產(chǎn)酯的影響

發(fā)酵液分別在23、25、28、30、32、34℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酒精度、殘?zhí)?、總酯、總酸、雜醇油，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

從表4可以看出，28℃發(fā)酵時(shí)總酯含量最高，為0.7862g/L；25℃時(shí)總酯含量為0.7755g/L；34℃時(shí)總酯含量最低，為0.6724g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，25~28℃發(fā)酵與其它溫度之間的總酯含量有顯著差異（P<0.05）。28℃發(fā)酵時(shí)酒精度最高，為4.65%（V/V），還原糖為10.95g/L；25℃時(shí)，酒精度為4.55%（V/V），還原糖為11.12 g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，25~28℃與其它發(fā)酵溫度之間的酒精度及還原糖有顯著差異（P<0.05）。

28℃發(fā)酵時(shí)總酸含量最高，為3.827g/L；23℃時(shí)總酸含量最低，為2.559g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，不同溫度之間的總酸含量有顯著差異（P<0.05）。23℃發(fā)酵時(shí)雜醇油含量最低，為0.054g/L；34℃時(shí)雜醇油含量最高，為0.110g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，不同溫度之間的雜醇油含量有顯著差異（P<0.05）。

表5 裝液量和振蕩對(duì)蜂蜜酒發(fā)酵中生香酵母產(chǎn)酯的影響

溫度是影響酵母菌生長(zhǎng)、發(fā)酵的重要因素。發(fā)酵期間溫度升高，酒精發(fā)酵旺盛，糖降快，酵母在糖降過程中積累較多的ATP使輔酶A活性增強(qiáng)，促進(jìn)酯類的生成[17]。此外，酵母細(xì)胞膜的流動(dòng)性增加，通透性得到提高，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的酯類的滲出，增加了蜂蜜酒中酯類的含量。若培養(yǎng)溫度過高,酵母出芽率會(huì)降低,衰老加快，酒精度呈下降趨勢(shì)，酯類生成減緩。上述觀點(diǎn)在本次實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步的驗(yàn)證，當(dāng)發(fā)酵溫度從23℃提高到28℃，總酯含量也從0.6517g/L上升到0.7862g/L，但隨著溫度進(jìn)一步提高，總酯含量呈下降趨勢(shì)，34℃發(fā)酵時(shí)總酯含量下降到0.6724g/L。

2.5 蜂蜜酒發(fā)酵中裝液量和振蕩對(duì)生香酵母產(chǎn)酯的影響

蜂蜜酒發(fā)酵中，不同裝液量及是否振蕩對(duì)生香酵母1437產(chǎn)酯的影響結(jié)果見表5。

從表5可以看出，裝液量為200mL和250mL且不振蕩時(shí)總酯含量最高，分別為0.8172、0.7679g/L；裝液量為200mL，160r/min振蕩培養(yǎng)10d后總酯含量最低，為0.4345g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，裝液量為200~250mL時(shí)的總酯含量顯著高于其它處理組（P<0.05）。

裝液量為200mL且不振蕩時(shí)酒精度最高，為7.58%（V/V）；裝液量為200mL，160r/min振蕩培養(yǎng)10d后酒精度最低，為1.95%（v/v）。方差分析及Duncan多重比較顯示，不同裝液量及振蕩之間的酒精度有顯著差異（P<0.05）。發(fā)酵液在160r/min振蕩培養(yǎng)10d后,殘?zhí)呛孔罡?，?9.56g/L；在200mL且不振蕩時(shí)殘?zhí)呛孔畹?，?7.73g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，不同裝液量及振蕩之間的殘?zhí)怯酗@著差異（P<0.05）。

發(fā)酵液在160r/min振蕩培養(yǎng)10d后總酸含量最高，為4.716g/L；裝液量為300mL時(shí)總酸含量最低，為2.436g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，不同裝液量及振蕩之間的總酸有顯著差異（P<0.05）。發(fā)酵液在160r/min振蕩培養(yǎng)10d后雜醇油含量最低，為0.052g/L；裝液量為300mL時(shí)雜醇油含量最高，為0.092g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，不同裝液量及振蕩之間的雜醇油有顯著差異（P<0.05）。

結(jié)果表明，發(fā)酵液靜止培養(yǎng)比振蕩培養(yǎng)產(chǎn)酯量高?？赡苁怯捎诎l(fā)酵液振蕩培養(yǎng)，生香酵母以生長(zhǎng)繁殖為主,細(xì)胞消耗較多的碳、氮營(yíng)養(yǎng)用以合成菌體,使產(chǎn)酯量受到影響。

2.6 接種釀酒酵母對(duì)蜂蜜酒發(fā)酵中生香酵母產(chǎn)酯的影響

選用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，因素水平見表6，結(jié)果及總酯的極差分析見表7。

表6 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

由表7可見，接種量對(duì)生香酵母1437產(chǎn)酯影響最大，接種菌種和接種時(shí)間對(duì)其影響較小。方差分析及Duncan多重比較顯示，接種量1%與其它接種量之間的總酯含量有顯著差異（P<0.05）；最優(yōu)因素水平組合為A2B1C3。按最優(yōu)因素水平組合A2B1C3進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以產(chǎn)酯量最高的4號(hào)實(shí)驗(yàn)的水平組合為對(duì)照，組合A2B1C3三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)總酯分別為0.9476、0.9342、0.9463g/L,其均值為0.9427g/L。對(duì)照所產(chǎn)總酯分別為0.8489、0.8628、0.8764g/L,其均值為0.8627g/L。方差分析及Duncan多重比較顯示，最優(yōu)因素水平組合A2B1C3的產(chǎn)酯量顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。

表7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及總酯極差分析

3 結(jié)論

本文對(duì)6株生香酵母在蜂蜜酒發(fā)酵中的產(chǎn)酯性能進(jìn)行了比較，并探討了乙醇含量、pH、溫度、裝液量及振蕩、接種釀酒酵母對(duì)生香酵母發(fā)酵和產(chǎn)酯能力的影響。結(jié)果表明，在蜂蜜酒發(fā)酵中，異常漢遜酵母異常變種1437產(chǎn)酯能力高；添加乙醇和接入釀酒酵母都有利于異常漢遜酵母異常變種1437產(chǎn)酯，但從總酯含量和酒的口感來看，以接種生香酵母（10%）的2d后接入1%的釀酒酵母1306較好；產(chǎn)酯開始時(shí)乙醇的含量以5%～6%比較合適，最適pH為5；產(chǎn)酯最適溫度為25～28℃，裝液量以40%～50%較高，連續(xù)振蕩不利于產(chǎn)酯。

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Comparison of the ability and condition of ester production of the aroma yeast in mead fermentation

TAO Shu-xing，SU Rui，XUE Jing，TIAN Ze-ying，CONG Yin，CHAI Xia
（College of Life Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Compared with the ability of ester production of the 6 strains of aroma yeast and discussed the condition of ester production of the aroma yeast in mead fermentation.The results showed that the strain of the highest production total ester content was Hansenula anomala var.anomala 1437，which was 0.8431g/L.For 1437，the good condition of producing ester were as follow:the initial alcohol contents was 5%～6%，the pH was 5，the fermentation temperature was at 25～28℃，loading volume was 40%～50%，continuous oscillations prevent producing ester，after two days of fermentation，adding 1%Saccharomyces cerevisiae 1306 increased the total ester contents in mead.

mead；the aroma yeast；total ester；the condition of ester production

TS201.3

A

1002-0306（2011）10-0234-05

蜂蜜酒是以蜂蜜為主要原料經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵而成，含有一定酒精度的飲用酒[1]?，F(xiàn)有專利、文獻(xiàn)、生產(chǎn)廠家生產(chǎn)蜂蜜酒，通常是使用釀酒酵母作為發(fā)酵劑，這種蜂蜜酒酒味明顯，但香氣不足，口感欠佳[2]。為了改善蜂蜜酒的口感，人們從蜂蜜選擇、釀酒酵母篩選、發(fā)酵溫度等多方面進(jìn)行了研究[3-6]。生香酵母具有產(chǎn)酯生香和一定的酒精發(fā)酵能力，在白酒固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)中采用生香酵母提高酒的酯含量已有很多成功的經(jīng)驗(yàn)[7]，在黃酒生產(chǎn)方面，也有同時(shí)使用釀酒酵母和生香酵母的文獻(xiàn)[8]。在蜂蜜酒發(fā)酵中，生香酵母能否發(fā)揮作用，有必要進(jìn)行研究。本文對(duì)6株生香酵母在蜂蜜酒發(fā)酵中的產(chǎn)酯性能進(jìn)行了比較，并對(duì)異常漢遜酵母異常變種（Hansenula anomala var.anomala）1437產(chǎn)酯生香的條件進(jìn)行了研究。

2010-11-25

陶樹興（1955-），男，副教授，主要從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。

陜西省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目（2009k11-03）。