梁 濤，徐曉琴，黃 金，蔡 謹(jǐn)，徐志南

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江杭州310027）

低酰基結(jié)冷膠提取工藝研究

梁 濤，徐曉琴，黃 金，蔡 謹(jǐn)，徐志南*

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江杭州310027）

目的：針對(duì)高粘度結(jié)冷膠發(fā)酵液，發(fā)展低?；Y(jié)冷膠提取工藝。方法：將濃度為16.5g/L的結(jié)冷膠發(fā)酵液pH調(diào)至10，于80℃下保溫20min，得低?；Y(jié)冷膠料液。料液經(jīng)CaCl2絮凝菌體后用板框過(guò)濾除菌，濾液稀釋6倍，加入堿性蛋白酶除蛋白，然后超濾濃縮4倍，再用活性炭脫色，最后用乙醇沉淀出結(jié)冷膠并干燥。結(jié)果：結(jié)冷膠回收率達(dá)76%，平均分子量為79萬(wàn)，透光率為86%，凝膠強(qiáng)度為890g/cm2。結(jié)論：使用該工藝提取低酰基結(jié)冷膠是可行的，產(chǎn)品質(zhì)量符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)冷膠，絮凝，過(guò)濾，除蛋白，脫色

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

結(jié)冷膠發(fā)酵液 結(jié)冷膠濃度16.5g/L，?；蕿?.02%；硅藻土、粉末活性炭、顆粒活性炭 溧陽(yáng)市良友活性炭廠；考馬斯亮藍(lán)G-250 上海沃凱公司；工業(yè)濾布 杭州昌源工業(yè)濾布有限公司；葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品 百靈威公司；牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 sigma公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司；FeSO4·7H2O、Al2（SO4）3·18H2O、CaCl2均為分析純。

Ultrospec 3300 Pro分光光度計(jì) Amersham Biosciences公司；Eppendorf centrifuge 5810R離心機(jī)Eppendorf公司；TA.TX 21物性測(cè)試儀 STABLE MICROSYSTEM公司；小型板框過(guò)濾機(jī) 沈陽(yáng)翔宇壓濾機(jī)有限公司；UF6-1812卷式超濾膜 北京安得膜分離技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 保溫時(shí)間對(duì)脫?；に嚨挠绊?將發(fā)酵液pH調(diào)至10，80℃下保溫脫酰基[3]，考察保溫時(shí)間對(duì)脫?；潭纫约吧禺a(chǎn)生量的影響。

1.2.2 絮凝劑的選擇 將低?；Y(jié)冷膠料液加水稀釋4倍，在80℃下選擇不同的絮凝劑分別于酸性、中性、堿性條件下進(jìn)行絮凝實(shí)驗(yàn)，絮凝2min后測(cè)定界面高度和上清液結(jié)冷膠含量。

沉降率=（初始液面高度-沉降后界面高度）/初始液面高度

結(jié)冷膠損失率=（料液中結(jié)冷膠含量-上清液結(jié)冷膠含量）/料液中結(jié)冷膠含量

1.2.3 過(guò)濾除菌工藝 向低?；Y(jié)冷膠料液中加入適量絮凝劑，然后用板框過(guò)濾去除菌體。過(guò)濾介質(zhì)為200目工業(yè)濾布，助濾劑為硅藻土，考察助濾劑用量（g/mL）及其添加方式、絮凝劑用量（g/mL）、過(guò)濾溫度、操作壓力、料液稀釋倍數(shù)以及結(jié)冷膠酰基含量（%）對(duì)除菌效果的影響。

1.2.4 酶法除蛋白工藝 將除菌后的發(fā)酵液用水稀釋6倍，加入蛋白酶，按照使用說(shuō)明中的溫度和pH進(jìn)行酶反應(yīng)，考察不同蛋白酶的除蛋白效果，以及除蛋白所需時(shí)間。

1.2.5 脫色工藝 將除蛋白后的料液用超濾進(jìn)行濃縮，然后添加吸附劑，在pH10，80℃下保溫一段時(shí)間進(jìn)行吸附脫色，然后過(guò)濾除去吸附劑，得脫色后的濾液。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體含量的測(cè)定 料液離心（5000r/min，15min）后用蒸餾水洗滌沉淀兩次，并于75℃下干燥至恒重，稱量得菌體含量。

1.3.2 結(jié)冷膠含量的測(cè)定 采用Bitter-Muir的咔唑法[8]測(cè)定其中葡萄糖醛酸含量，經(jīng)換算得到結(jié)冷膠含量。

1.3.3 色素含量的測(cè)定 由可見(jiàn)光波長(zhǎng)掃描結(jié)果可知，色素在400nm處有最大吸收，以此波長(zhǎng)下的吸光率來(lái)表示色素含量。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.3.5 分子量測(cè)定 采用凝膠過(guò)濾（GPC）進(jìn)行測(cè)定。柱型號(hào)：60cm長(zhǎng)，直徑1.5cm（xk16，pharmacia biotech，swedan）；填充料：Fractogel EMD BioSEC（Merck ltd，UK）；檢測(cè)器：折射檢測(cè)器（RI）model 1755（bio-rad laboratories，Germany）；記錄器：model YT1000（Howe co.ltd.UK）；洗脫液：75mmol/L氯化四甲銨，加入0.05%的疊氮化鈉作為保護(hù)劑；洗脫液流速：25mL/h，蠕動(dòng)泵（model P-1，Pharmacia Biotech，Sweden）。用66.9、182、509、1000ku的右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。取8mg的脫乙酰結(jié)冷膠樣品溶解于2mL的洗脫液中，然后用過(guò)濾器（Whatman fiters GF/C，1.2μm孔徑）過(guò)濾，去除殘存細(xì)胞和不溶的結(jié)冷膠凝聚物，進(jìn)樣量0.2mL。

1.3.6 ?；康臏y(cè)定 參照秦方[9]的酸堿滴定法測(cè)定結(jié)冷膠中?；暮俊?/p>

1.3.7 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定 用TA.TX 21物性測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)定[10]。

1.3.8 透光率的測(cè)定 稱取0.5g樣品，加蒸餾水100mL，將燒杯置于80℃水浴中，樣品溶解后加入2.7%的氯化鈣溶液2mL，補(bǔ)充蒸發(fā)水量至原體積，趁熱將膠溶液傾入比色皿，立即放入20℃恒溫箱中放置15min。用分光光度計(jì)在497nm處測(cè)定透光率，用蒸餾水對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 保溫時(shí)間對(duì)結(jié)冷膠?；?、料液色素產(chǎn)生量的影響

結(jié)冷膠料液在pH10，80℃下保溫可脫掉?；鵞3]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵液殘留10g/L左右的葡萄糖，在堿性和高溫環(huán)境下發(fā)生一系列反應(yīng)使得發(fā)酵液顏色不斷加深。保溫時(shí)間過(guò)短?；撾x不完全，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)發(fā)酵液顏色過(guò)深，增加后續(xù)脫色的難度，因此需要對(duì)保溫時(shí)間進(jìn)行研究。結(jié)果如圖1所示，結(jié)冷膠的脫?；屎桶l(fā)酵液色素產(chǎn)生量隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。保溫20min時(shí)，?；淹耆摰簦^續(xù)延長(zhǎng)保溫時(shí)間只會(huì)增加發(fā)酵液色素含量，因此采用保溫20min來(lái)制備低?；Y(jié)冷膠料液，下文中提到的低?；弦憾际窃诖藯l件下制備。

圖1 保溫時(shí)間對(duì)脫?；潭?、色素含量、菌體去除的影響

2.2 絮凝劑、pH對(duì)絮凝效果的影響

由于發(fā)酵液粘度較高，影響菌體絮凝顆粒的沉降，從而影響對(duì)絮凝劑性能的判斷，因此將低酰基料液稀釋4倍降低其粘度后進(jìn)行絮凝實(shí)驗(yàn)。pH不僅能影響菌體表面所帶電荷，而且還能影響絮凝劑的性質(zhì)，因此對(duì)絮凝效果有顯著影響[11]。如表1所示：酸性條件下殼聚糖和CaCl2沒(méi)有絮凝效果，沉降率都為0；而Al2（SO4）3、FeSO4雖然絮凝效果較好，但是結(jié)冷膠損失較大，在50%左右。這是因?yàn)榻Y(jié)冷膠是陰離子型線性聚合物[12]，在酸性條件下，分子間的靜電作用力減弱容易沉淀下來(lái)。中性條件下，絮凝劑的絮凝效果都較弱，沉降率都小于0.3。堿性條件下，殼聚糖的絮凝效果仍然較差，而其余三種絮凝劑的絮凝效果較好，其中FeSO4的絮凝效果最好，沉降率和結(jié)冷膠損失率分別為0.81、0.15，其次是CaCl2，分別為0.7、0.17。但是使用FeSO4后，料液變成褐綠色，并且有焦臭味，考慮到食品的色澤和風(fēng)味問(wèn)題，選擇CaCl2作為絮凝劑。

表1 不同絮凝劑的絮凝效果

2.3 過(guò)濾除菌工藝

通常情況下，菌體絮凝沉降后取上清液回收產(chǎn)品，但是當(dāng)結(jié)冷膠濃度較高，料液粘度較大時(shí)，加入絮凝劑所形成的絮凝顆粒較小，沉降后上清液仍然比較渾濁。若要取得較好的菌體去除效果，需要將料液進(jìn)行稀釋，增加了處理量；并且廢棄的絮凝顆粒含水量還很高，造成產(chǎn)品的回收率低，因此菌體絮凝后采用板框過(guò)濾來(lái)去除菌體。

2.3.1 助濾劑添加方式和操作壓力的影響 1%的硅藻土以3種方式進(jìn)行使用：a.全部加入到料液中；b.全部涂布在濾布上；c.將助濾劑按1:1的比例分別涂布在濾布上，加入到料液中。其中料液透過(guò)率=透過(guò)液體積/過(guò)濾前料液體積；過(guò)濾速率=透過(guò)液體積/（濾布面積×過(guò)濾時(shí)間）。

結(jié)果如圖2所示：對(duì)于方式1，在壓力小于0.1MPa的范圍內(nèi)，隨著壓力增高，過(guò)濾速率有所增加，但是料液透過(guò)率有所減小；當(dāng)壓力大于0.1MPa時(shí)，過(guò)濾速率和料液透過(guò)率急劇下降；對(duì)于方式2和方式3，過(guò)濾速率隨壓力的增大而增大，料液透過(guò)率也在0.7以上。這是因?yàn)榉绞?和方式3中絮凝菌體顆粒被助濾劑截留，不會(huì)堵塞濾布，而方式1中菌體顆粒直接將濾布堵塞；相同壓力下方式3的過(guò)濾速率比方式2高，是因?yàn)榉绞?中涂布于濾布上的助濾劑量多，濾餅較厚，增大了過(guò)濾的阻力。因此助濾劑的添加方式應(yīng)該采用方式3，壓力選為0.2MPa。

圖2 助濾劑添加方式對(duì)過(guò)濾效果的影響

2.3.2 過(guò)濾溫度、氯化鈣用量、助濾劑（硅藻土）用量、料液稀釋倍數(shù)、?；潭葘?duì)過(guò)濾除菌效果的影響 溫度、氯化鈣用量對(duì)低?；Y(jié)冷膠料液過(guò)濾除菌效果的影響如圖3所示，溫度越高分子熱運(yùn)動(dòng)越強(qiáng)烈，菌體凝聚作用越弱，80℃除菌效果明顯好于85℃。無(wú)CaCl2絮凝時(shí)，菌體去除率僅為0.2左右，當(dāng)加入0.05%CaCl2時(shí)，菌體去除率可達(dá)到0.65左右。CaCl2用量的增加有助于除菌效果的增強(qiáng)，但當(dāng)CaCl2用量增加到0.2%時(shí)，繼續(xù)增加其用量除菌效果提高并不大。助濾劑用量以及稀釋倍數(shù)對(duì)除菌效果的影響如圖4和圖5所示，稀釋倍數(shù)越大，菌體去除效果越好；當(dāng)助濾劑用量增大時(shí)，菌體去除效果隨之增強(qiáng)。因此可以在80℃下通過(guò)增加CaCl2、助濾劑、稀釋倍數(shù)來(lái)增強(qiáng)除菌效果，其結(jié)果如表2所示：增加CaCl2用量到0.25%，僅0.5%的助濾劑就使得結(jié)冷膠的損失率高達(dá)0.34，而且菌體去除率僅為0.75。增加稀釋倍數(shù)到6倍，雖然菌體去除率為0.91，結(jié)冷膠損失率僅為0.1，但是稀釋倍數(shù)過(guò)大工業(yè)應(yīng)用并不經(jīng)濟(jì)。增加助濾劑用量至3%，此時(shí)菌體去除率和結(jié)冷膠損失率分別為0.94、0.13。因此應(yīng)該采用增加助濾劑用量來(lái)增強(qiáng)除菌效果，除菌工藝參數(shù)選為：CaCl2用量0.05%，過(guò)濾溫度80℃，助濾劑用量3%。并在此條件下研究了?；潭葘?duì)除菌效果的影響，結(jié)果表明，酰基化程度越高，菌體去除率越低。目前人們對(duì)菌體絮凝機(jī)理認(rèn)識(shí)還不多[13]，沒(méi)有相關(guān)的理論支持。本實(shí)驗(yàn)中?；潭葘?duì)菌體去除有較大影響可能是因?yàn)榻Y(jié)冷膠通過(guò)酰基與細(xì)胞纏繞在一起，屏蔽了絮凝劑對(duì)菌體的絮凝作用。

圖3 溫度、CaCl2用量對(duì)除菌效果的影響注：0.5%硅藻土，pH10。

圖4 助濾劑用量以及稀釋倍數(shù)對(duì)除菌效果的影響注：0.05%CaCl2，80℃，pH10，發(fā)酵液未稀釋。

圖5 稀釋倍數(shù)對(duì)菌體去除效果的影響注：0.05%CaCl2，80℃，pH10，助濾劑0.5%。

表2 不同除菌方式對(duì)結(jié)冷膠損失的影響（80℃，pH10）

2.4 酶法除蛋白工藝

2.4.1 不同蛋白酶除蛋白效果的比較 結(jié)冷膠的結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，不易受酶的影響而引起降解[14]，可以使用酶來(lái)去除蛋白質(zhì)。選擇不同的蛋白酶在其最適條件下進(jìn)行反應(yīng)，由于此類酶在高溫下容易失活，而高濃度的結(jié)冷膠料液在低溫靜止?fàn)顟B(tài)下會(huì)形成凝膠，因此需將料液稀釋6倍，并不斷攪拌進(jìn)行酶反應(yīng)。蛋白去除效果如表3所示，其中堿性蛋白酶的除蛋白效果最好。這是由于堿性蛋白酶可能更適合水解料液中的蛋白質(zhì)，而且堿性條件下結(jié)冷膠溶液的粘度較低，傳質(zhì)效率較高，酶反應(yīng)速率較快。

表3 不同蛋白酶除蛋白效果

2.4.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶除蛋白的影響 由圖6可以看出，隨著堿性蛋白酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的去除率逐漸增加，到4h后蛋白質(zhì)去除率不再增加，因此蛋白酶的作用時(shí)間選為4h。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白去除率的影響

2.5 脫色工藝

由于除蛋白工藝中將料液稀釋了6倍，增加了處理量，因此采用超濾進(jìn)行濃縮，這樣不僅可以降低后續(xù)工藝的處理量，而且能去除一部分小分子物質(zhì)如色素、氨基酸等。

2.5.1 濃縮倍數(shù)對(duì)膜通量的影響 超濾過(guò)程在pH10， 80℃，0.05MPa（表壓）下進(jìn)行，膜通量隨濃縮倍數(shù)的增大而減小，如圖7所示。這是因?yàn)榻Y(jié)冷膠濃度在不斷增大，料液的粘度也隨之增加；另一方面，膜在不斷被污染，導(dǎo)致膜通量的減少。當(dāng)濃縮倍數(shù)為4倍時(shí)（此時(shí)體積為原始發(fā)酵液的1.5倍）停止超濾。超濾過(guò)程能除去一部分色素，剩下的色素采用吸附脫色的方法來(lái)去除。

圖7 膜通量與濃縮倍數(shù)的關(guān)系

2.5.2 脫色劑的選擇 向pH10，80℃料液中分別加入經(jīng)過(guò)預(yù)處理的強(qiáng)堿性離子交換樹(shù)脂（D750、D730、D301），大孔吸附樹(shù)脂（SD300）以及活性炭（粉狀、顆粒狀），磁力攪拌40min進(jìn)行脫色。結(jié)果如表4所示，其中粉末活性炭的脫色效果最好。這可能是因?yàn)槊撋珪r(shí)間較短，色素還沒(méi)有及時(shí)進(jìn)入樹(shù)脂孔內(nèi)，而粉末活性炭由于比表面積較大，在短時(shí)間內(nèi)容易吸附色素，因此色素去除率較高。工業(yè)上較長(zhǎng)時(shí)間保溫不僅增加成本，而且生產(chǎn)效率低，采用樹(shù)脂脫色是不經(jīng)濟(jì)的，因此采用活性炭脫色。

表4 不同脫色劑的脫色效果（pH10，40min）

3 結(jié)論

通過(guò)以上研究得出了提取低?；Y(jié)冷膠的相關(guān)工藝：將濃度為16.5g/L的結(jié)冷膠發(fā)酵液pH調(diào)至10，80℃下保溫20min，得低?；Y(jié)冷膠料液。80℃下加入0.05%CaCl2絮凝菌體后用板框過(guò)濾除菌，過(guò)濾介質(zhì)為200目工業(yè)濾布，助濾劑為硅藻土，添加量為3%，平均分配于料液和濾布。濾液用水稀釋6倍后加入0.3%的堿性蛋白酶，pH10，55℃下保溫4h。蛋白水解后在80℃下將料液超濾濃縮4倍，然后添加1%活性炭，并于80℃保溫40min，過(guò)濾除去活性炭后，濾液用3倍體積的乙醇沉淀結(jié)冷膠。結(jié)冷膠回收率為76%，平均分子量為79萬(wàn)，透光率為86%，凝膠強(qiáng)度為890g/cm2。

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Study on extraction method of deacetylated gellan gum

LIANG Tao,XU Xiao-qin,HUANG Jin,CAI Jin,XU Zhi-nan*
（Department of Chemical and Biological Engineering of Zhejiang University,Hangzhou 310027,China）

Objective:Develop a method for extracting deacetylated gellan gum from high viscosity broth.Method: Keep fermentation broth at 80℃，pH10 for 20min to make gellan gum deacetylated.Then add CaCl2to flocculate cells，and the solution was filtrated to remove cell mass.After cell removing，the solution was diluted and alkaline protease was added to remove protein.Then concentrate the solution with ultrafiltration and remove the pigment using active carbon.At last deposit the gellan gum with alcohol，after drying the refined product was made. Result:The total recovery，molecular weight，transparency，gel strength of deacetylated gellan gum was 76%， 790 000，86%，890g/cm2respectively.Conclusion:The method was feasible for extracting deacetylated gellan gum，and the product is in accordance with related standard.

gellan gum；flocculation；filtration；deproteinization；decolorization

TS201.2

B

1002-0306（2011）10-0368-05

結(jié)冷膠是美國(guó)Kelco公司于20世紀(jì)80年代新開(kāi)發(fā)出來(lái)的陰離子型微生物線形多糖[1]，其單體含2分子D葡萄糖、1分子D葡萄糖醛酸和1分子L鼠李糖。運(yùn)用光散射法及特性粘度法測(cè)得脫酰基產(chǎn)品的分子量在0.5～1.0×106u之間[2]。結(jié)冷膠可分為高酰基和低?；鶅煞N類型，一般經(jīng)微生物直接合成的結(jié)冷膠富含乙?；透视王；?，稱為高?；Y(jié)冷膠；將其經(jīng)過(guò)堿處理脫掉酰基就可得到低?；Y(jié)冷膠[3]。低酰基結(jié)冷膠不僅穩(wěn)定，而且具有良好的凝膠性能，與傳統(tǒng)凝膠劑（如卡拉膠、瓊脂等）相比，僅需0.25%的用量，即可達(dá)到1.5%瓊脂和1%卡拉膠所能達(dá)到的凝膠強(qiáng)度，因此低?；Y(jié)冷膠在食品、醫(yī)藥、科研等領(lǐng)域有著廣泛用途[4-6]，具有良好的市場(chǎng)前景。食品和醫(yī)藥用的優(yōu)質(zhì)結(jié)冷膠產(chǎn)品需要精制，而結(jié)冷膠是高粘性的微生物代謝產(chǎn)物，膠體圍繞細(xì)胞以粘性聚合物的形式構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[7]，給結(jié)冷膠的提取帶來(lái)了不小的困難。目前的研究主要集中在發(fā)酵方面，提取工藝報(bào)道較少。在實(shí)驗(yàn)室一般是將發(fā)酵液大量稀釋后降低其粘度，然后離心除去菌體，此方法在工業(yè)應(yīng)用上并不經(jīng)濟(jì)，因此對(duì)適合工業(yè)化的提取工藝進(jìn)行研究具有重要意義。

2010-10-25 *通訊聯(lián)系人

梁濤（1986-），男，在讀碩士研究生，主要從事多糖分離研究。