李 燕,李冬冬,宋,陶傳敏

(1.成都中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術學院;2.四川大學華西醫(yī)院實驗醫(yī)學科,四川成都610041)

表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis,SE)屬于條件致病菌,其毒力較低,僅產(chǎn)生一種毒素-溶血性的δ毒素,故常引起亞急性感染;近年來隨著生物材料如人工瓣膜、人工關節(jié)在臨床的廣泛應用,以及留置靜脈導管等侵入性操作的增多,表皮葡萄球菌引起的臨床感染日益增多,已成為醫(yī)院感染中最重要的病原之一。雖然體外實驗顯示感染細菌對抗生素敏感,但在體內(nèi)表皮葡萄球菌卻難以被清除,表皮葡萄球菌在體內(nèi)粘附材料表面形成生物膜是導致感染和耐藥的重要原因,生物膜的形成是其致病的主要毒力因素。對實驗室而言,評估表皮葡萄球菌臨床分離菌株生物膜形成能力不僅為判斷表皮葡萄球菌的毒力提供依據(jù),而且對臨床有效控制表皮葡萄球菌感染具有重要意義。

本文參考相關文獻,采用4種方法檢測了臨床分離的45株表皮葡萄球菌體外生物膜形成能力,并對其臨床應用價值進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集成都地區(qū)兩家醫(yī)院患者臨床標本中分離的45株表皮葡萄球菌,刪除同一患者相同感染部位分離的重復分離菌株。所有菌株均經(jīng)過臨床鑒定。以表皮葡萄球菌ATCC 12228株為生物膜形成的陰性對照株。

1.1.2 主要試劑及儀器 LB肉湯自配、葡萄糖、結晶紫、瓊脂糖均為國產(chǎn)分析純。細菌DNA提取試劑盒、PCR反應試劑盒購自四川天澤基因公司;PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)為BIO-RAD公司產(chǎn)品、掃描電鏡為日立1000B。

1.2 方法

1.2.1 剛果紅實驗 按文獻[1]選擇血平板分離的單個菌落接種于剛果紅培養(yǎng)基(剛果紅0.8 g/L,腦心浸液干粉37 g/L,蔗糖50 g/L,瓊脂粉12 g/L),37℃培養(yǎng)24 h后再在室溫放置24 h,觀察結果。菌落黑色、干燥并出現(xiàn)結晶為生物膜陽性菌株,而紅色、光滑菌落為不產(chǎn)生物膜菌株。

1.2.2 半定量粘附實驗檢測表皮葡萄球菌生物膜形成 按文獻方法[2],略作改動。將LB肉湯培養(yǎng)18 h的表皮葡萄球菌用新鮮LB肉湯(0.25%葡萄糖)按1∶200比例稀釋。將0.2 ml稀釋后的菌液加人96孔平底組織培養(yǎng)盤,每株分別移入4個平行孔。37℃培養(yǎng)18 h后,吸干每孔菌液,然后用 PBS(pH7.2)緩沖液洗板3次,然后用BOUIN固定液固定,用結晶紫染色,洗去未粘附細菌,晾干,每孔加入200μl丙酮酒精,微振蕩,酶標儀檢測每孔的A570nm值。生物膜形成陽性株篩選條件為:陰性對照菌株平均A值±3倍標準差為界定值,以平均A值大于界定值為生物膜形成株。

1.2.3 掃描電鏡觀察表皮葡萄球菌生物膜形成將表皮葡萄球菌接種于無糖2ml LB%肉湯中,37℃培養(yǎng)過夜后,取15μl接種六孔組織培養(yǎng)板,每孔加入0.25%糖LB 3ml,每孔放入無菌蓋片,37℃孵育,48 h后更換培養(yǎng)液(PBS洗三次后,加入含0.5%糖LB),第二次換夜后孵育24h,取出蓋片,PBS洗三次。2.5%戊二醛4℃固定過夜后,無菌水沖洗干凈。30%,50%,70%,80%,90%,100%乙醇,各4℃脫水10min,進行掃描電鏡觀察。

1.2.4 PCR檢測icaA基因 模板DNA提取嚴格按基因組DNA提取試劑盒說明書進行。模板DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。icaA基因引物根據(jù)GeneBank中icaA基因序列(staphylococcus epidermidis RP62A,CP000029),經(jīng)NCBIPrimer-Blast設計并檢測其特異性 ,序列為 :5’GAGGGAATCAAACAAGCA-3’,5’-AGGCACTAACATCCAGCA-3’,由上海生物工程公司合成;PCR擴增條件:94℃預變性4 min,94℃30 sec,47℃60 sec,72℃1 min,共30個循環(huán),72℃延伸10 min。擴增后取5μl反應產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測及成像。擴增產(chǎn)物為405 bp DNA片段。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,結果采取行×列表χ2檢驗分析,α=0.05為檢驗水準,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4種方法檢出表皮葡萄球菌生物膜形成能力

半定量粘附實驗中,以ATCC 12228株作為陰性對照測得界定值為0.110,以平均A值大于0.110的菌株為生物膜陽性株,平均A值小于或等于0.110的菌株為生物膜陰性株。剛果紅實驗、PCR擴增icaA基因、掃描電鏡實驗結果見圖1、2、3。

45株臨床分離的表皮葡萄球菌有13株4種方法檢測均能形成生物膜,27株4種方法檢測均不能形成生物膜,余5株檢測結果不盡相同,見表1。剛果紅實驗、半定量粘附實驗、掃描電鏡實驗、PCR擴增icaA檢出的陽性率分別為31.1%、40.0%、40.0%、28.9%,無統(tǒng)計學差異(χ2=1.80,P ＞0.05)。

2.2 靈敏度(sensitivity,SE)和特異性(specificity,SP) 以掃描電鏡結果為真陽性標準,其他3種方法檢測表皮葡萄球菌生物膜形成的靈敏度和特異性見表2。

圖1 剛果紅實驗結果

圖2 表葡菌株ica基因PCR產(chǎn)物電泳圖

圖3 72 h生物膜掃描電鏡圖(1 000 kv 10 000×)

檢測方法 剛果紅實驗 半定量粘附實驗PCR擴增icaA 合計+ -+ -+ -掃描電鏡 + 14 4 18 0 13 5 18- 0 27 0 27 0 27 27合計 14 31 18 27 13 32

表2 3種方法檢出表皮葡萄球菌生物膜形成能力的靈敏度和特異性

3 討論

生物膜的形成是細菌為適應自然環(huán)境而采取的一種策略。生物膜保護細菌,對抗抗生素和機體免疫吞噬作用的特征是生物材料相關感染性疾病的重要原因之一。目前有關生物膜的形成機制研究已成為熱點,也取得了較大的進展,但如何快速、有效地評估細菌生物膜的形成能力,幫助臨床快速控制感染方面卻明顯不足。由于生物膜形成是一個復雜耗時的多基因調控、多因子參與的過程,因此,各個實驗室體外檢測生物膜形成的方法各不相同、操作程序缺乏標準化。目前生物膜形成能力的檢測方法主要有胞外粘附基質檢查法和顯微鏡形態(tài)學觀察法,常用方法有剛果紅實驗[1]、半定量粘附實驗[2]、銀染法、掃描電鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡等,均為表性檢查方法。剛果紅實驗為胞外多糖粘附素(PIA)染色法,生物膜形成過程中產(chǎn)生的胞外多糖粘附素與剛果紅牢固結合,使菌落呈現(xiàn)紅色,其操作簡便快速,是生物膜形成的定性檢測方法;半定量粘附實驗為胞外粘附基質的結晶紫染色法,是表型檢測的傳統(tǒng)方法,但其操作較為復雜耗時;掃描電鏡可直接觀察生物膜的獨特結構,結果更為準確,被認為是檢測生物膜形成能力的“金標準”,但實驗條件要求太高,且價格昂貴,難以滿足臨床實驗室對生物膜形成能力的評估要求。近年來,隨著有關生物膜形成機制研究的深入,越來越多的證據(jù)顯示ica操縱子是生物膜形成的重要基因,其編碼產(chǎn)生胞外多糖粘附素(PIA)是生物膜形成的最好橋梁,體外研究也證明PIA是表皮葡萄球菌逃逸免疫攻擊和毒力所必需的[3,4]。Arciola CR等[5]就認為PCR法檢測ica基因是非常有效的診斷技術,可大大提高生物膜細菌的診斷陽性率。因此,本次實驗采用了剛果紅實驗、半定量粘附實驗、掃描電鏡3種表型檢測法和PCR擴增icaA基因檢測了45株臨床分離的表皮葡萄球菌,結果顯示4種方法的陽性檢出率分別為31.1%、40.0%、40.0%、28.9%,陽性檢出率無差異(χ2=1.80,P＞0.05)。

本次實驗以掃描電鏡觀察為“金標準”,發(fā)現(xiàn)半定量粘附實驗的靈敏度和特異性均為100.0%,提示該方法可作為篩查生物膜形成的可靠方法,且價格低廉,若有經(jīng)驗豐富的技術人員,可作為常規(guī)檢查應用于臨床;剛果紅實驗、PCR擴增icaA兩種方法的特異性均為100.0%,靈敏度分別為 77.8%、77.2%,這與Arciola CR等的報道略有差異,提示生物膜形成可能存在獨立于ica和PIA之外的機制存在。Qin Z等[6]就報道表皮葡葡萄球菌細胞表面相關蛋白(Autolysin E,AltE,altE基因編碼)具有粘附玻璃粘連蛋白(Vitronectin,Vn)活性,可以促使表皮葡萄球菌與宿主蛋白包被的生物材料結合,介導細菌黏附于多聚物表面,若altE基因缺失,細菌粘附能力下降;Rohde H等[7]也證實了在全髖關節(jié)(THA)和膝人工關節(jié)成形術(TKA)后人工關節(jié)感染中分離到的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中存在著聚集相關蛋白(accumulation associated protein,AAP,aap基因編碼)介導的生物膜形成機制。因此,在臨床實踐中,特別是標本量較大的實驗室中,可考慮利用剛果紅實驗、PCR擴增icaA的簡便快速、特異性高的特點,對表皮葡萄球菌生物膜形成能力進行過篩檢查?？梢苫蜿幮跃陝t可以通過半定量粘附實驗加以證實。

總之,表皮葡萄球菌生物膜形成能力的檢測對臨床控制生物材料引起的醫(yī)院感染有著舉足輕重的作用,其方法的標準化不可忽視,尚需要大樣本的、廣泛的深入研究,才能得到客觀、準確的檢測結果,真正為臨床治療生物膜引起感染提供幫助。

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[5]Arciola CR,Campoccia D,Baldassarri L,etal.Detectionof biofilm formation in Staphylococcus epidermidis from implant infection.,comparison of a PCR-method that recognize the presence of ica geneswith two classic phenotypicmethods[J].JBiomed Mater RESA,2006,76(2):425.

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