陳戰(zhàn)芬 王曉勇 郭子建

(1湖北師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，黃石 435002)(2南京大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210093)(3南京大學(xué)配位化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，配位化學(xué)研究所，南京 210093)

2，6-二[(2′-甲酚基-2″-羥乙基)氨甲基]-對(duì)-甲酚合四鋅（Ⅱ）促進(jìn)DNA水解的研究

陳戰(zhàn)芬＊,1,3王曉勇2郭子建3

(1湖北師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，黃石 435002)
(2南京大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210093)
(3南京大學(xué)配位化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，配位化學(xué)研究所，南京 210093)

本文利用圓二色、熒光光譜和瓊脂糖凝膠電泳等方法考察了一個(gè)四核鋅熒光配合物[ZnⅡ4(L-3H)2](ClO4)2·3.5H2O(I，L＝2,6-二[(2′-甲酚基-2″-羥乙基)氨甲基]-對(duì)-甲酚)與DNA的結(jié)合性質(zhì)及其DNA水解酶活性。結(jié)果表明，配合物I能通過與DNA磷酸骨架的共價(jià)結(jié)合誘導(dǎo)其構(gòu)象變化，而本身的熒光被淬滅。該四核鋅配合物能在生理?xiàng)l件和不加任何輔助劑情況下水解切割pBR322質(zhì)粒DNA，且在60 μmol·L-1時(shí)表現(xiàn)出最大的切割效果，使DNA的水解速率提高了6～7個(gè)數(shù)量級(jí)。

四核鋅熒光配合物；DNA；水解切割

核酸中的磷酸二酯鍵具有很高的穩(wěn)定性，所以能在生理?xiàng)l件下催化切割DNA的試劑在生物工程和基因治療藥物等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。金屬配合物特有的電子和結(jié)構(gòu)性質(zhì)使其對(duì)DNA具有天然的親和力，從而有可能成為有效的核酸酶。關(guān)于金屬配合物催化DNA降解的研究大都集中在氧化切割或DNA模型化合物的水解上，對(duì)DNA本身水解的報(bào)道卻為數(shù)較少。然而在生物體內(nèi)天然核酸酶降解DNA所采用的模式是水解斷裂，水解斷裂相對(duì)于氧化斷裂有諸多優(yōu)點(diǎn)，因此有關(guān)金屬配合物的水解型DNA切割試劑的設(shè)計(jì)與合成倍受關(guān)注。本文首先用圓二色和熒光光譜研究了一個(gè)具有熒光活性的四核鋅配合物[Zn4Ⅱ(L-3H)2](ClO4)2·3.5H2O(I，該配合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖 1[3]；其中 L＝2，6-二[(2′-甲酚基-2″-羥乙基)氨甲基]-對(duì)-甲酚)與DNA的結(jié)合性質(zhì)，其次用瓊脂糖凝膠電泳研究了該配合物對(duì)質(zhì)粒DNA的切割活性及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

小牛胸腺DNA(CT-DNA)，溴化乙錠(EB)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)購(gòu)自Sigma公司。pBR322質(zhì)粒DNA購(gòu)自MBI Fermentas公司。瓊脂糖膠購(gòu)自Biowest公司。 T4 DNA 連接酶 (350 U/μL)，10×T4 DNA連接酶緩沖液和核酸瓊脂糖回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。四核鋅配合物I按文獻(xiàn)[3]提供的方法合成。圓二色(CD)光譜在Jasco-810自動(dòng)光譜儀上測(cè)定；熒光光譜在AMINCO Bowman series 2發(fā)光光譜儀上測(cè)定。

1.2 光譜法研究配合物I與CT-DNA的結(jié)合能力

配合物I與DNA間的相互作用用圓二色(CD)和熒光光譜進(jìn)行研究。CT-DNA的儲(chǔ)存液在50 mmol·L-1NaCl/5 mmol·L-1Tris-HCl的緩沖溶液(pH 7.4)中配制得到。DNA的濃度通過測(cè)定其在260 nm處的吸光度來(lái)確定 (DNA在260 nm處的摩爾消光系數(shù)為 6 600 L·mol-1·cm-1[4])， 且在 260 和280 nm 處的吸收強(qiáng)度之比(A260/A280)為 1.8～1.9，表明該DNA樣品不含蛋白質(zhì)[5]。該儲(chǔ)備液在4℃保存且使用不超過4 d。四核鋅配合物的初溶液在50%甲醇和 50%的緩沖溶液(5 mmol·L-1Tris-HCl/50 mmol·L-1NaCl，pH 7.4)中配制，初濃度為 13.5 mmol·L-1。

在室溫下，固定CT-DNA的濃度在1.31 mmol·L-1， 將配合物 I溶液分別按 r(cI/cDNA)＝1∶80；1∶40；1∶20；1∶16；1∶10；1∶8 和 1∶4 的比例加入到 DNA 的溶液中，記錄每次的CD光譜。掃描波長(zhǎng)范圍為220～320 nm，掃速 10 nm·min-1，數(shù)據(jù)記錄間隔 0.1 nm，每次掃描背景均被自動(dòng)扣除。

固定四核配合物 I 的濃度為 45 μmol·L-1，將CT-DNA 溶 液 分 別 按 r(cDNA/cI)＝0；0.1；0.2；0.3；0.4；0.5；0.6；0.7；0.8 和 0.9 的比例加入到配合物的溶液中，記錄每個(gè)比例下的熒光光譜 (激發(fā)波長(zhǎng)為298 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為330 nm)。

1.3 配合物I對(duì)質(zhì)粒DNA的切割實(shí)驗(yàn)

利用瓊脂糖凝膠電泳的方法研究配合物I對(duì)DNA的切割作用。將超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA(200 μg·L-1，1 μL) 與一定量的配合物 I 混合，用50 mmol·L-1Tris-HCl/50 mmol·L-1NaCl(pH＝7.4)緩沖液定容到10 μL。混勻后，反應(yīng)液在37℃下溫育12 h，然后加入 1.5 μL 終止緩沖劑(含溴酚藍(lán)、甘油、EDTA和二甲苯腈藍(lán))終止反應(yīng)，用EB染色的1.0%凝膠電泳分析切割結(jié)果。電泳測(cè)定在TAE(40 mmol·L-1Tris-醋酸/1 mmol·L-1EDTA)緩沖液，60 V 電壓下進(jìn)行1.5 h，用UVP凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳圖進(jìn)行拍照。每一條泳帶的切割程度是通過對(duì)EB染色的凝膠(EB,0.5 μg·mL-1)進(jìn)行光密度分析。由于 EB 與超螺旋DNA的嵌入作用低于開環(huán)(FormⅠ)及線性DNA(FormⅡ)，故定量DNA時(shí)應(yīng)在得到的超螺旋DNA含量上乘以一個(gè)校正因子1.47[6]。制備所用溶液樣品均用二次去離子水，每個(gè)實(shí)驗(yàn)都平行地進(jìn)行3次。

在機(jī)理研究中，0.1 mol·L-1的 DMSO，10 mmol·L-1的叔丁醇(羥基自由基捕捉劑)或 10 mmol·L-1的NaN3(單線態(tài)氧捕捉劑)，或 10 mmol·L-1的 KI(過氧化氫捕捉劑)加入到pBR322質(zhì)粒DNA和配合物I的混合溶液中，在37℃溫育12 h后停止反應(yīng)，隨后的處理和分析參照上述方法進(jìn)行。另外為進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)理研究，T4連接酶實(shí)驗(yàn)按下操作進(jìn)行。按照核酸瓊脂糖回收試劑盒的使用說(shuō)明，將配合物I切割pBR322質(zhì)粒DNA所得的開環(huán)和線性DNA回收，回收的產(chǎn)物中加入1 μL的10×T4 DNA連接酶緩沖溶液和 0.6 μL 的 T4 連接酶(350 U·μL-1)，在 23 ℃溫育60 min后終止反應(yīng)，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)是在等同條件下未用T4連接酶處理的樣品。

配合物I對(duì)超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA的切割隨著反應(yīng)時(shí)間的變化實(shí)驗(yàn)在12 h內(nèi)完成，相應(yīng)的處理和分析同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜法研究配合物I與DNA間的相互作用

由于配合物I能跟H2PO4-共價(jià)作用[3]，DNA是由脫氧核糖和磷酸根組成的分子骨架，那么配合物I也有可能通過類似的結(jié)合模式與DNA發(fā)生相互作用。由于該配合物的紫外最大吸收波長(zhǎng)與小牛胸腺DNA(CT-DNA)的最大吸收波長(zhǎng)260 nm相近，所以配合物I與DNA的相互作用在這里主要利用圓二色(CD)和熒光光譜進(jìn)行研究。

圖2表示CT-DNA本身和配合物I存在下的CD光譜。在圖中245 nm的負(fù)峰和275 nm的正峰是標(biāo)準(zhǔn)B-DNA的特征峰[7]。隨著配合物I濃度的增加，CD光譜中正峰和負(fù)峰的強(qiáng)度均降低，這表明配合物I與DNA之間發(fā)生了相互作用，并誘導(dǎo)DNA構(gòu)象發(fā)生一定程度的改變。在圖3中，配合物I的熒光強(qiáng)度隨著CT-DNA濃度的增加而逐漸減小，也說(shuō)明I與CT-DNA發(fā)生了作用，而且這種熒光淬滅的效果與文獻(xiàn)報(bào)道的磷酸根淬滅作用相似[3]。所以，配合物I可能是通過同樣的結(jié)合模式與DNA上的磷酸根發(fā)生了螯合作用。

2.2 配合物I的切割活性

利用瓊脂糖凝膠電泳的方法研究了配合物I在生理?xiàng)l件下切割pBR322質(zhì)粒DNA的活性。圖4所示的是不同濃度的配合物I與pBR322質(zhì)粒DNA在pH 7.4、37℃下溫育12 h后的切割電泳圖。切割產(chǎn)物的平均定量結(jié)果列于表1。由圖可以看出，當(dāng)配合物 I的濃度為 5 μmol·L-1時(shí)(圖 4b 中 lane 3)，I就可將超螺旋DNA(FormⅠ)降解為開環(huán)(FormⅡ)和線性DNA(FormⅢ)。隨著配合物I濃度的增加，F(xiàn)ormⅠ型DNA逐漸的減少，F(xiàn)ormⅡ和FormⅢDNA逐漸增加。當(dāng)配合物的濃度大約為30 μmol·L-1時(shí) (b中l(wèi)ane 6)，F(xiàn)ormⅠ DNA完全轉(zhuǎn)變?yōu)镕ormⅡ和FormⅢ。繼續(xù)增加配合物I的濃度，F(xiàn)ormⅡDNA的部分轉(zhuǎn)化為FormⅢ。繼續(xù)提高配合物I的濃度到60 μmol·L-1，配合物I誘導(dǎo)DNA斷裂產(chǎn)生60.1%的 Form Ⅱ和 39.9%的 Form Ⅲ DNA產(chǎn)物(a中l(wèi)ane 5)。但是再繼續(xù)提高配合物I的濃度 (大于60 μmol·L-1)，切割效果降低(如圖 4a 中 lane 6～9)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明60 μmol·L-1的配合物I對(duì)DNA產(chǎn)生最大的切割效果。 相比之下，600 μmol·L-1的 Zn(ClO4)2·6H2O(a 中 lane 10)和 120 μmol·L-1配體本身(b中l(wèi)ane 2)并沒有誘導(dǎo)DNA的斷裂。

表1 不同濃度的配合物I與pBR322質(zhì)粒DNA孵化12 h后切割產(chǎn)物的定量分析結(jié)果Table 1 Quantified data for different forms of DNA produced by complex I at different concentrations

2.3 配合物I的DNA切割機(jī)理的探討

一般來(lái)說(shuō)，超螺旋DNA(FormⅠ)的一條鏈上有一個(gè)缺口時(shí)，會(huì)使超螺旋結(jié)構(gòu)變得松弛，得到缺刻環(huán)狀(或稱開環(huán))DNA。如果在互補(bǔ)鏈上，距離第一個(gè)缺口大約12個(gè)堿基以內(nèi)的長(zhǎng)度再有一個(gè)缺口時(shí)，會(huì)得到線性DNA[8-9]。因此，配合物I定在DNA上切割了2次，將DNA從FormⅠ轉(zhuǎn)變?yōu)镕ormⅢ型。如圖4所示的線性DNA的形成可以由超螺旋DNA經(jīng)兩種反應(yīng)途徑獲得。第1種是單鏈切割機(jī)理，超螺旋DNA首先被隨機(jī)地轉(zhuǎn)變?yōu)殚_環(huán)形式，再被切割試劑在DNA的另處再切一刀使其轉(zhuǎn)變成線性DNA。典型的例子如DNA的印跡試劑FeMPE[10]和人脫氧核糖核酸酶I(DNase I)[11]。第2種是雙鏈切割機(jī)理，這種情況下線性DNA是由超螺旋DNA通過雙鏈切割直接轉(zhuǎn)變而成。典型的例子如鐵-博來(lái)霉素。電泳圖中3種不同形式的DNA條帶同時(shí)共存這一現(xiàn)象可為此過程的發(fā)生提供有力證據(jù)[12-14]。上面濃度梯度實(shí)驗(yàn)中所觀察到的凝膠電泳圖(圖4)中的3種DNA條帶共存，說(shuō)明了配合物I誘導(dǎo)形成線性DNA主要是通過雙鏈斷裂來(lái)完成的?；赑oisson分布和Freifelder-Trumbo關(guān)系式的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)分析辦法[6,15]，在我們的實(shí)驗(yàn)中，n1/n2(其中n1和n2分別表示每一DNA分子產(chǎn)生單鏈斷裂和雙鏈斷裂的數(shù)目)的值為3.8(5 μmol·L-1)，6.7(10 μmol·L-1)和 7.2(20 μmol·L-1)。這些值都遠(yuǎn)小于100，說(shuō)明配合物I誘導(dǎo)線性DNA形成主要是通過非任意的切割方式來(lái)完成的。

DNA斷裂的途徑有2種：活性氧物種導(dǎo)致的氧化斷裂和親核試劑(水或羥基離子)引發(fā)的水解斷裂。在這里為了確定配合物I促使DNA的斷裂是水解斷裂，我們首先在體系中加入各種不同的活性氧物種捕捉試劑進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)(見圖5)。研究表明體系中加入DMSO、NaN3、KI和叔丁醇幾乎對(duì)DNA的切割不產(chǎn)生影響，說(shuō)明了擴(kuò)散性的羥自由基、單線態(tài)氧和過氧化氫等都不包含在切割過程中。結(jié)合我們研究報(bào)道I跟磷酸根作用結(jié)果[3]，我們初步斷定配合物I斷裂DNA不是通過氧化途徑，而是通過水解DNA的磷酸二酯鍵完成的。為了進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)結(jié)論，我們還利用T4連接酶對(duì)配合物I在最佳反應(yīng)條件下導(dǎo)致的切割產(chǎn)物進(jìn)行了連接實(shí)驗(yàn)。其瓊脂糖電泳圖見圖6所示。用T4連接酶處理過的樣品與相應(yīng)的未處理過的樣品相對(duì)照，從電泳條帶位移發(fā)現(xiàn)T4連接酶能一定程度的將開環(huán)和線性化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化為閉合環(huán)狀或連環(huán)狀的形式。經(jīng)T4連接酶連接后在電泳條帶上超螺旋DNA處似乎出現(xiàn)兩條條帶，這也許是由于兩個(gè)方面的原因造成的，一方面，連接酶與DNA非共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致連接起來(lái)的連環(huán)體超螺旋態(tài)有些致后；另一方面，連接后的超螺旋不再是原來(lái)那種緊密堆積的形式，也就是其密度減少，導(dǎo)致條帶有些致后。定量分析說(shuō)明連接的效率大約為40～60%。顯然，這種DNA片斷的有效連接結(jié)果證明了配合物I誘導(dǎo)DNA斷裂反應(yīng)是通過水解途徑進(jìn)行的。

2.4 配合物I水解DNA的動(dòng)力學(xué)

另外我們選取了配合物I的濃度為60 μmol·L-1時(shí)，研究配合物誘導(dǎo)DNA斷裂隨反應(yīng)時(shí)間的變化規(guī)律。其瓊脂糖凝膠電泳圖顯示在圖7。當(dāng)體系溫育1 h后，就有線性DNA出現(xiàn)。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，超螺旋(FormⅠ型)DNA繼續(xù)減少，開環(huán)(FormⅡ)DNA和線性(Form III)DNA的量繼續(xù)增加。當(dāng)體系溫育4 h，F(xiàn)ormⅠ型DNA完全消失，全部轉(zhuǎn)化為FormⅡ型和FormⅢ型DNA。繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，F(xiàn)ormⅡ型DNA開始部分地轉(zhuǎn)化為FormⅢ型。在測(cè)試的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，線性DNA達(dá)到55.39%的最大量時(shí)，開環(huán)DNA達(dá)到44.61%。通過對(duì)瓊脂糖凝膠上的3種DNA形態(tài)含量分布的定量分析，我們可以估計(jì)每一條泳道中DNA磷酸二酯鍵水解的程度。對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)單的動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果顯示在圖8。動(dòng)力學(xué)曲線顯示，隨時(shí)間增加，F(xiàn)ormⅢDNA的形成和FormⅠDNA的減少遵從準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)，曲線的變化符合單指數(shù)式衰減規(guī)律，從曲線擬合可以求出37℃下，當(dāng)配合物 I濃度為 60 μmol·L-1時(shí)，水解的速率常數(shù)為 1.89 h-1(Form I 的減少；R2＝0.995)和 0.23 h-1(Form Ⅲ的增加；R2＝0.945)。 而在無(wú)催化劑的生理?xiàng)l件下，雙鏈DNA磷酸二酯鍵的一級(jí)水解速率常數(shù)為 3.6×10-8h-1[16]，相比之下配合物 I使 DNA 的水解速度提高了6～7個(gè)數(shù)量級(jí)。這種DNA水解速率的加速作用是Lewis酸活化作用 (磷酸根的氧配位到金屬離子上)和分子內(nèi)醇氧或者橋式酚氧的親核活化二者共同作用的結(jié)果[17]。在配合物I中4個(gè)Zn（Ⅱ）通過橋連酚氧原子形成2個(gè)雙金屬中心，通過配合物I選擇性識(shí)別磷酸根的分析[3]，我們推測(cè)這2個(gè)雙重Lewis協(xié)同結(jié)合磷?；?(如圖9所示)，導(dǎo)致了與Zn（Ⅱ）配位的醇羥基從Zn（Ⅱ）中心上解離下來(lái)[18]。脫離下來(lái)的醇羥基可一方面作為一般堿或親核試劑進(jìn)攻磷酸酯中心磷原子，另一方面通過氫鍵與DNA上磷酸酯結(jié)合，有利于離去基團(tuán)的離去。同時(shí)橋式酚氧也可能發(fā)揮其親核活化作用[19]。共同的作用效果促進(jìn)水解斷裂反應(yīng)的發(fā)生。

3 結(jié) 論

四核鋅熒光配合物[ZnII4(L-3H)2](ClO4)2·3.5H2O(I)與DNA的結(jié)合引起DNA構(gòu)象一定程度的改變和配合物熒光強(qiáng)度的淬滅。這種效果可能是由配合物與DNA磷酸根的配位結(jié)合產(chǎn)生的。瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明，配合物I可以在生理?xiàng)l件下水解切割pBR322 質(zhì)粒 DNA，且在 60 μmol·L-1時(shí)表現(xiàn)出最強(qiáng)的切割效果，使DNA的水解速率提高了6～7個(gè)數(shù)量級(jí)。這種切割效果可能來(lái)源于2個(gè)雙Lewis酸活化和分子親核試劑活化2個(gè)過程的協(xié)同作用。

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DNA Hydrolysis Mediated by a Tetranuclear Zinc（Ⅱ）Complex with 2,6-Bis{[(2-hydroxybenzyl)(2-hydroxyethyl)amino]methyl}-4-methylphenol

CHEN Zhan-Fen＊,1,3WANG Xiao-Yong2GUO Zi-Jian3
(1College of Chemistry and Environmental Engineering,Hubei Normal University,Huangshi,Hubei 435002,China)
(2State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology,School of Life Science,Nanjing University,Nanjing 210093,China)(3State Key Labortory of Coordination Chemistry,Institute of Coordination Chemistry,Nanjing University,Nanjing 210093,China)

DNA binding properties and hydrolase activity of a fluorescent tetranuclear Zinc（Ⅱ） complex [ZnⅡ4(L-3H)2](ClO4)2·3.5H2O (I,L ＝2,6-bis{[(2-hydroxybenzyl)(2-hydroxyethyl)amino]methyl}-4-methylphenol),were monitored by circular dichroism (CD),fluorescence spectroscopy and agarose gel electrophoresis.The results indicate that I binds to phosphate backbones of DNA covalently.The interaction induces the conformational variation of DNA double helix and the fluorescence quenching of I.The complex can mediate rapid hydrolytic cleavage of pBR322 plasmid DNA under physiological conditions (pH＝7.4)and in the absence of any external agents.And I exhibits its optimal DNA hydrolytic activity at the concentration of 60 μmol·L-1and the rate of DNA hydrolysis was a 6～7-fold acceleration.

fluorescent tetranuclear Zinc（Ⅱ）complex;DNA;hydrolytic cleavage

A

1001-4861(2011)10-1945-07

2011-05-05。收修改稿日期：2011-06-08。

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)(No.20631020)；江蘇省自然科學(xué)基金重點(diǎn)(No.BK2005209)；湖北師范學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(2007F11)資助項(xiàng)目。＊

。 E-mail：chenzf1979@sohu.com