王雪云，吳彥萍，葉才文，梁富，黃致翔，徐爾贊，劉愛和，郭土敬

深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司，廣東 深圳 518107

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）可引起新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19），該病是一種呼吸系統(tǒng)疾病，傳染性和變異性極高，已在全球范圍內(nèi)傳播開來［1-2］。目前，根據(jù)WHO報道，截止2022年2月，全球累計確診病例438 609 586例，累計死亡5 981 281例，由于COVID-19防控難度大，給人類健康和全球經(jīng)濟造成較大影響［3］。接種疫苗是預(yù)防COVID-19及降低重癥率和死亡率的有效手段。

目前在研疫苗中，核酸疫苗（包括DNA疫苗和mRNA疫苗）相對于傳統(tǒng)的滅活疫苗和重組蛋白疫苗，屬于新興領(lǐng)域，且DNA疫苗具有更高的穩(wěn)定性和安全性，且具有生產(chǎn)工藝簡單，成本低等優(yōu)點［4-7］。目前，DNA疫苗的免疫方式最常用的是肌肉注射，但其免疫原性通常較弱，很難單獨誘導(dǎo)出保護性免疫反應(yīng)［8-12］。本研究DNA疫苗所用質(zhì)粒（pDRVI3.0-S）采用載體pDRVI3.0，是一種可有效增強SARSCoV-2 S蛋白在體內(nèi)高效表達(dá)的載體［13］，解決了DNA疫苗免疫原性弱的缺點。

根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心發(fā)布的《預(yù)防用DNA疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，將超螺旋結(jié)構(gòu)的比例作為評價質(zhì)粒DNA的標(biāo)準(zhǔn)，環(huán)狀結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒所占比例應(yīng)在90%以上［14］。據(jù)相關(guān)研究報道，超螺旋DNA的結(jié)構(gòu)更為緊密，更易于進入細(xì)胞核，且其是唯一適應(yīng)于在真核細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出生物活性的天然完整結(jié)構(gòu)［15-17］。因此，相比于其他拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，超螺旋DNA在治療應(yīng)用中最為有效［18］。

目前常用的分離超螺旋DNA和其他拓?fù)湟踪徯问劫|(zhì)粒DNA的方法是使用cytiva公司商品化的親和層析填料plasmidselect xtra，其通過Sepharose 6FF為基架與配體2巰吡啶共價結(jié)合，通過超螺旋DNA和其他拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與配體的結(jié)合力不同來分離純化超螺旋DNA［19-23］。但SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗（pDRVI3.0-S）質(zhì)粒較大（＞10 000 bp），純化時極難使其超螺旋含量穩(wěn)定達(dá)到90%以上。而相關(guān)研究很少涉及對SARS-CoV-2 DNA疫苗超螺旋構(gòu)型提升工藝的報道。

本研究對親和層析填料plasmidselect xtra上樣條件進行優(yōu)化，旨在建立一種純化效果顯著、重復(fù)性好的可分離含SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗超螺旋質(zhì)粒DNA和開環(huán)質(zhì)粒DNA的純化方法，為建立SARS-CoV-2 DNA疫苗的規(guī)?；a(chǎn)工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 含重組質(zhì)粒pDRVI3.0-S的宿主菌E.coliDH5α由中國疾病預(yù)防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）邵一鳴教授惠贈。

1.2 主要試劑及儀器DNA分子量marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他常規(guī)試劑購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Sepharose 6FF和plasmidselect xtra純化介質(zhì)、AKTA explorer 100液相色譜儀、XK16／70和XK26／40層析柱均購自美國Cytiva公司；BIOTECH-100JSA發(fā)酵罐系統(tǒng)購自上海保興生物設(shè)備工程有限公司；核酸蛋白檢測儀購自美國Eppendof公司。

1.3E.coli的發(fā)酵與收獲-70℃取含質(zhì)粒pDRVI3.0-S的E.coliDH5α菌種，涂布于含卡那霉素（25 μg／mL）的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～16 h；接種至3 mL含卡那霉素（50 μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃，180～220 r／min培養(yǎng)12～16 h；按1%取樣接種至100 mL含卡那霉素（50 μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃，180～220 r／min培養(yǎng)12～16 h；將培養(yǎng)菌液全部轉(zhuǎn)入含10 L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，pH 7.0，控制攪拌速度及空氣流量，使攪拌速度維持在40%～60%，發(fā)酵16 h。發(fā)酵液12 230×g離心30 min，收集菌體。

1.4E.coli的裂解與濃縮100 g菌體中加入600 mL溶液Ⅰ（25 mmol／L Tris，50 mmol／L Glu，10 mmol／L EDTA，pH 8.0），充分?jǐn)噭?；隨即加入1 200 mL溶液Ⅱ（0.2 mol／L NaOH，1% SDS），輕柔攪拌5 min；緩慢加入1 200 mL溶液Ⅲ（3 mol／L乙酸鉀，2 mol／L冰乙酸，pH 5.5），輕柔攪拌至全部呈蛋花狀，靜置30 min；200目尼龍布過濾后，分別用5和0.5 μm濾芯過濾澄清，得到澄清裂解液。

采用孔徑為300 NMWC的0.5 m2超濾膜包進行濃縮，將2 700 mL濃縮液濃縮至270 mL（10倍濃縮），采用TE緩沖液（10 mmol／L Tris，1 mmol／L EDTA，pH 8.0）等體積洗濾5倍。

1.5 分子篩層析 采用分子篩Sepharose 6FF去除RNA及雜蛋白，用3倍柱體積（CV）溶液A（2.0 mol／L硫酸銨，100 mmol／L Tris，10 mmol／L EDTA，pH 7.5）平衡柱床（線性流速60 cm／h）。將濃縮的樣品按線性流速60 cm／h上樣，上樣量為20%。上樣結(jié)束后，同樣用溶液A按線性流速60 cm／h進行洗脫，得到分子篩層析收集液。取樣檢測收集液濃度、純度及超螺旋含量。

1.6 親和層析上樣條件的優(yōu)化

1.6.1 正交試驗設(shè)計 根據(jù)親和層析填料的性質(zhì)對親和層析上樣樣品的硫酸銨濃度（A）、氯化鈉濃度（B）、上樣載量（C）3種因素進行優(yōu)化，因素水平表見表1，設(shè)計方案見表2。

表1 親和層析上樣條件優(yōu)化試驗因素水平表Tab.1 Factors and levels for optimization of condition for sample loading in affinity chromatography

1.6.2 樣品溶液的制備 按表2處方，用溶液B（4.0 mol／L硫酸銨，100 mmol／L Tris，10 mmol／L EDTA，pH 7.5）及固體氯化鈉調(diào)節(jié)樣品中硫酸銨和氯化鈉濃度，按正交試驗組別制備樣品溶液，備用。

表2 親和層析上樣條件優(yōu)化正交試驗設(shè)計Tab.2 Design of orthogonal test for optimization of condition for sample loading in affinity chromatography

1.6.3 親和層析純化 用3倍CV溶液A平衡柱床（線性流速120 cm／h），根據(jù)樣品濃度調(diào)節(jié)上樣體積，根據(jù)正交試驗組別控制上樣載量。上樣結(jié)束后，用溶液A洗脫開環(huán)質(zhì)粒，溶液C（1.7 mol／L硫酸銨，0.3 mol／L氯化鈉，100 mmol／L Tris，10 mmol／L EDTA，pH 7.5）洗脫超螺旋質(zhì)粒，收集洗脫峰，取樣檢測純度、濃度及超螺旋質(zhì)粒含量。

1.7 不同批次樣品的親和層析純化 取3批不同批次制備的樣品（20200716、20200730、20200813），按1.6項超螺旋含量最優(yōu)條件處理樣品，并進行親和層析純化。收集洗脫峰，取樣檢測純度、濃度及超螺旋質(zhì)粒含量。

1.8 純化質(zhì)粒DNA的檢測

1.8.1 超螺旋含量 采用瓊脂糖凝膠電泳分析洗脫樣品，用含質(zhì)粒染色液（gelstain）的0.8%瓊脂糖凝膠電泳，圖譜分析軟件quantity one分析收集樣品中的超螺旋構(gòu)型含量。

1.8.2 純度及質(zhì)粒DNA含量 將質(zhì)粒DNA樣品置于核酸蛋白檢測儀，選定核酸檢測，讀取A260／280值及濃度值。

2 結(jié)果

2.1 分子篩層析 超濾濃縮液經(jīng)分子篩Sepharose 6FF處理后，收集的質(zhì)粒峰經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，已無RNA條帶，其超螺旋質(zhì)粒DNA和線性質(zhì)粒DNA見圖1。經(jīng)凝膠電泳成像系統(tǒng)掃描，超螺旋質(zhì)粒DNA占比為54.71%。

圖1 濃縮液分子篩層析收集液超螺旋含量比例分析Fig.1 Percentage of supercoil content in harvest from molecular sieve chromatography of concentrate

2.2 親和層析上樣正交試驗優(yōu)化結(jié)果9組處理后樣品親和層析收集液的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2，親和層析圖譜見圖3。未經(jīng)優(yōu)化前，分子篩層析洗脫收集液經(jīng)親和層析處理后，質(zhì)粒回收率為57.60%，超螺旋含量占比為86.86%，回收率低且超螺旋含量不能達(dá)到90%及以上。從正交結(jié)果極差分析可知，影響親和層系質(zhì)?；厥章始俺菪空急鹊囊蛩刂鞔雾樞蚓鶠椋毫蛩徜@濃度＞上樣量＞氯化鈉濃度。超螺旋含量占比最優(yōu)組合為A2B3C1，見表3，即硫酸銨濃度2.3 mol／L，氯化鈉濃度0.5 mol／L，上樣載量1.0 g／L，超螺旋含量為92.12%。

表3 不同正交組別質(zhì)粒回收率及超螺旋質(zhì)粒DNA含量Tab.3 Plasmid recovery rates and supercoiled plasmid DNA contents in various orthogonal groups

圖2 正交設(shè)計不同組別親和層析收集液的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.2 Agarose gel electrophoretic profile of harvest from affinity chromatography in various groups in orthogonal design

圖3 正交設(shè)計不同組別的親和層析色譜圖Fig.3 Affinity chromatograms of various groups in orthogonal design

2.3 不同批次樣品親和層析純化結(jié)果 不同批次樣品按優(yōu)化條件處理后，樣品中的超螺旋構(gòu)型含量穩(wěn)定在92%以上，見表4及圖4。

圖4 不同批次樣品親和層析純化后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoretic profile of various batches of samples purified by affinity chromatography

表4 不同批次樣品親和層析純化后的超螺旋構(gòu)型含量及質(zhì)粒回收率（%）Tab.4 Supercoiled configuration contents and plasmid recovery rates in various batches of samples purified by affinity chromatography（%）

3 討論

超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒DNA含量占比不小于90%是DNA疫苗藥用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明確指出的關(guān)鍵指標(biāo)。因此，在DNA疫苗制備過程中非常關(guān)注超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒DNA的純化工藝。工業(yè)化生產(chǎn)中，常采用親和層析（plasmidselect）柱層析法獲得超螺旋構(gòu)象DNA［24-25］。親和層析填料Plasmidselect是LEMMENS等基于疏水層析的技術(shù)基礎(chǔ)上，在體積排阻填料Sepharose 6FF引入芳香硫醇，根據(jù)不同結(jié)構(gòu)DNA與其結(jié)合力不同來進行分離。

參照現(xiàn)有資料提供的純化工藝參數(shù)［26］，本研究采用親和層析（plasmidselect）柱層析法對pDRVI3.0-S質(zhì)粒進行純化，獲得的pDRVI3.0-S質(zhì)粒DNA超螺旋含量在80%～90%之間，即部分非超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA雜質(zhì)也隨超螺旋結(jié)構(gòu)DNA同時洗脫下來，不符合藥用DNA疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。究其原因，在現(xiàn)有純化工藝條件下，本研究所用的含SARS-CoV-2 S蛋白的質(zhì)粒DNA開環(huán)結(jié)構(gòu)與超螺旋結(jié)構(gòu)在plasmidselect填料上的結(jié)合力相差不大，出現(xiàn)同時洗脫下來的情況。而開環(huán)結(jié)構(gòu)與超螺旋結(jié)構(gòu)最主要的差異為兩者的疏水性不同。表明優(yōu)化硫酸銨濃度和氯化鈉濃度，改變其溶液疏水性，可有效地將超螺旋質(zhì)粒DNA與線性及開環(huán)質(zhì)粒DNA分離開。

本研究對分子篩層析收集的SARS-CoV-2的質(zhì)粒DNA樣品采用正交法進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)樣品中增加硫酸銨及氯化鈉終濃度能有效增加質(zhì)粒DNA超螺旋構(gòu)型含量。連續(xù)3批試驗結(jié)果可以看出，純化SARS-CoV-2 DNA疫苗質(zhì)粒超螺旋構(gòu)型時，樣品中加入2.3 mol／L硫酸銨，0.5 mol／L氯化鈉，上樣量1 g／L能穩(wěn)定地將超螺旋質(zhì)粒DNA含量提高至92%以上。值得注意的是，再次提高硫酸銨或氯化鈉濃度可進一步提升質(zhì)粒pDRVI3.0-S超螺旋構(gòu)型的含量，但會降低其回收率，這可能與pDRVI3.0-S質(zhì)粒在高鹽條件下結(jié)合能力下降有關(guān)。

SARS-CoV-2 DNA疫苗的超螺旋構(gòu)型占比是其是否符合藥用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵指標(biāo)。目前學(xué)術(shù)上未發(fā)現(xiàn)有提高pDRVI3.0-S超螺旋構(gòu)型純化工藝的報道。本研究基于親和層析填料plasmidselect xtra，在前期大量研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化硫酸銨和氯化鈉濃度，有效分離了pDRVI3.0-S的超螺旋構(gòu)型和線性及開環(huán)構(gòu)型。本研究建立的SARS-CoV-2 S蛋白DNA疫苗超螺旋構(gòu)型純化工藝穩(wěn)定，分辨率高，易于控制且成本低，為pDRVI3.0-S DNA疫苗的規(guī)?；a(chǎn)提供了試驗依據(jù)，推動了基因治療的進一步發(fā)展。