伍慧蘭

(湖南第一師范學(xué)院，湖南長沙410205)

湖南省泡狀帶絳蟲線粒體nad1基因的序列測定及分析

伍慧蘭

(湖南第一師范學(xué)院，湖南長沙410205)

以從我國湖南長沙和湘西犬小腸中采集的2條泡狀帶絳蟲作為研究對象，用引物JB11及JB12擴(kuò)增泡狀帶絳蟲的pnad1片段，應(yīng)用C lustalX 1.81程序?qū)π蛄羞M(jìn)行比對，同時利用DNAstar5.0中的Megalign程序進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示來自湖南長沙和湘西的2條泡狀帶絳蟲的pnad1序列均為391bp。研究結(jié)果為泡狀帶絳蟲進(jìn)一步的分類、鑒定和遺傳變異研究奠定了基礎(chǔ)。

泡狀帶絳蟲；線粒體DNA；nad1基因；序列分析

泡狀帶絳蟲（Taeniahydatigena）寄生于犬、狼和狐貍等動物的小腸內(nèi)。絳期幼蟲（細(xì)頸囊尾蚴，Cysticercus tenuicollis）寄生于豬、綿羊、山羊的肝臟漿膜、大網(wǎng)膜、腸系膜、肝、肺等處，對幼齡動物危害極大，偶爾也可感染人[1-2]。因此，正確鑒定泡狀帶絳蟲，對預(yù)防和控制該病的發(fā)生具有重要意義。線粒體基因組具有結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳、缺少重組、進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，特別適合作為遺傳學(xué)研究的標(biāo)記[3-5]。本研究以采自湖南長沙和湘西地區(qū)犬小腸中的泡狀帶絳蟲為研究對象，對其nad1基因的部分序列(pnad1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，旨在為泡狀帶絳蟲的分類、鑒別診斷以及本病的防治等研究提供依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料

1.蟲體樣品：本研究所用的泡狀帶絳蟲樣品采自湖南長沙(CSTY1)和湖南湘西(XXTY1)。

2.主要試劑：Taq酶（大連寶生物公司產(chǎn)品），蛋白酶K（Merck公司產(chǎn)品）。WizardTMDNA Clean-up System（Promega公司產(chǎn)品）、PCR 試劑（Buffer、MgCl2、dNTPs）為大連寶生物公司產(chǎn)品。

3.樣品DNA的制備：從70%酒精保存液中取出單個蟲體，置于1.5mL Eppendorf管中。按照Promega公司基因組DNA提取試劑盒（Wizard SV Genomic DNA Purification System）的使用說明書提取泡狀帶絳蟲基因組DNA，將提取的基因組DNA置于﹣20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）方法

1.PCR擴(kuò)增用Bowles[6]等報道的引物JB10和JB11來擴(kuò)增線粒體pnad1，其序列為：JB11：5'-AGATTCGTAAGGGGCCTAATA-3' 和 JB12：5'-ACCACTAACTAATTCACTTTC-3'。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。反應(yīng)體系為25μL，其中10×PCR buffer2.5 μL；MgCl2 4 μL；dNTPs（25mM）2 μL；Primer（50 pmol/μL）0.25 μL；Taq polymerase（5 U/μL）0.25 μL；雙蒸水 14.75 μL；模板 DNA 1 μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30 s，55℃退火 30 s，2℃延伸 30 s，共 37個循環(huán)，最后 72℃后延伸5min。取2μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色，紫外投射儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。PCR產(chǎn)物保存?zhèn)溆谩?/p>

2.測序：將PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測序，然后進(jìn)行序列比較和分析。

3.nad1基因序列測定及其在種系發(fā)育分析中的應(yīng)用：將PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司直接測序，測序結(jié)果用DNAstar 5.0軟件進(jìn)行分析。從GenBankTM檢索現(xiàn)有帶科絳蟲nad1序列（表1），然后與之進(jìn)行相似性比對和帶科絳蟲種系發(fā)育分析。利用Clustal X1.81及Mega 4.0軟件對獲得的CSTY1、XXTY1和GenBankTM的泡狀帶絳蟲nad1基因序列進(jìn)行比對及計(jì)算遺傳距離，然后用Phylip 3.67程序中的最大簡約法 (Maximum parasimony，MP)繪制種系發(fā)育樹，以豬蛔蟲Ascaris suum（AS）為外群。最大簡約法采用Branch and bound模型分析，采用自展檢驗(yàn)(bootstrap test)估算所構(gòu)建系統(tǒng)樹的可靠性，復(fù)制數(shù)均為1000。同時利用DNAstar 5.0中的Megalign程序進(jìn)行相似性分析。

表1 不同帶科絳蟲的nai1序列信息

二、結(jié)果

（一）PCR擴(kuò)增結(jié)果

2個泡狀帶絳蟲樣品均成功地?cái)U(kuò)增出約450 bp的pnad1，與預(yù)期目的片段長度相符，且無非特異性條帶，空白對照為陰性，PCR產(chǎn)物電泳圖見圖1。

（二）測序結(jié)果及分析

2個樣品pnad1堿基序列長度相同，均為433bp，剔除引物后，均得到391bp的序列。A+T的含量分別為 72.38﹪(CSTY1)和 72.12﹪(XXTY1)，樣品序列與GenBankTM收錄的泡狀帶絳蟲成蟲的相應(yīng)序列(pnad1登錄號為GQ228819)進(jìn)行比較，經(jīng)DNAstar 5.0的MegAlign軟件分析顯示，兩個蟲株的pnad1測序結(jié)果與該序列變異的序列的變異堿基數(shù)皆小于4，湘西分離株的變異率為0.5﹪和長沙分離株的變異率為0.2﹪。進(jìn)一步對本研究所測泡狀帶絳蟲pnad1序列之間進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)湘西分離株和長沙分離株泡狀帶絳蟲序列僅側(cè)在存在著1個基因位點(diǎn)變異。中核苷酸序列表現(xiàn)為第148位堿基“A→G”的轉(zhuǎn)變)（見圖2），證明泡狀帶絳蟲nad1基因的部分序列pnad1種內(nèi)高度保守，兩地的泡狀帶絳蟲在pnad1序列存在的微小差異可認(rèn)為是地理差異。

（三）nad1基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹

采用MP法建樹方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3)顯示，湖南長沙分離株和湖南湘西分離株具有高度同源性，與GenBankTM中報道的泡狀帶絳蟲位于同一分枝，系統(tǒng)發(fā)生樹中的Bootstrap值分別在96%以上，2個分離株所屬分枝與其他帶科所屬分支相隔較遠(yuǎn)。

三、討論

為了有效診斷、治療和控制寄生蟲病，有必要對寄生蟲蟲株作精確的鑒定和分類。對寄生蟲蟲種及其變種的進(jìn)化史及分類學(xué)上關(guān)系方面的認(rèn)識，不僅具有學(xué)術(shù)上的價值，而且為今后的研究和控制寄生蟲病提供重要的資料。與核基因組DNA相比，線粒體具有相對分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、母性遺傳、無組織特異性等特點(diǎn)。線粒體基因間不發(fā)生重組，可以反映出母系的進(jìn)化歷史，這樣線粒體一個基因就可以代表整個線粒體基因組的變異情況。mtDNA作為一種核外遺傳物質(zhì)，也正是由于mtDNA的這些特點(diǎn)，使之成為研究寄生蟲系統(tǒng)進(jìn)化的一種很好的分子標(biāo)記[7]。在絳蟲的分類鑒定和群體遺傳方面，許多學(xué)者研究認(rèn)為，線粒體基因序列是理想的遺傳標(biāo)記[8-9]。

本研究應(yīng)用PCR技術(shù)對采自湖南長沙和湘西地區(qū)的泡狀帶絳蟲樣品的線粒體DNAnad1基因的部分序列（pnad1）進(jìn)行了分析，并與GenBank報道的泡狀帶絳蟲成蟲的pnad1序列進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自中國青海省的泡狀帶絳蟲成蟲和湖南長沙、湘西地區(qū)犬小腸中的泡狀帶絳蟲的pnad1的序列存在3個堿基的差異，而湖南長沙和湘西的2個樣品泡狀帶絳蟲的pnad1的序列僅存在1個堿基差異，這種微小差異可以認(rèn)為是地理差異。采用最大簡約法構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示出湖南分離株與Taenia hydatigena位于同一分枝高度同源，湖南分離株所屬分枝與其他絳蟲所屬分枝相隔較遠(yuǎn)。本試驗(yàn)PCR擴(kuò)增了泡狀帶絳蟲pnad1序列并進(jìn)行了序列分析，為泡狀帶絳蟲的分子分類學(xué)和分子遺傳學(xué)的進(jìn)一步研究提供了初步依據(jù)。

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SequenceMeasurementand AnalysisofMitochondrialNADH Dehydrogenase Subunit1 ofTaeniaHydatigenaCollected from Hunan Province

WU Hui-lan

(Hunan FirstNormalUniversity,Changsha,Hunan 410205)

To analyze them itochondrialNADH dehydrogenase subunit1(nad1)gene ofTaeniahydatigena collected from Hunan province,one should follow the three steps.Firstly,the partialnad1(pnad1)isamplified from eachTaeniahydatigenasample.Thenpnad1sequencesare aligned by using the ClustalX 1.81.Lastly,sequence homology analysis isconducted by using the Megalign program of the software DNAStar version 5.0.The result shows that the length ofpnad1is 391bp.This result has provided a foundation for further studies ofmolecular identification and moleculargeneticsofTaeniahydatigena.

taeniahydatigena；MitochondrialDNA；nad1 gene；sequence analysis

R383.3

A

1674-831X（2011）04-0137-05

2011-04-12

湖南第一師范學(xué)院院級課題（XY10N 01)

伍慧蘭（1962—），女，湖南郴州人，湖南第一師范學(xué)院教師，主要從事生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作。

[責(zé)任編輯：胡 偉]