韓 雪 汪 勇 胡長(zhǎng)鷹 王麗麗 劉元法 王興國(guó)

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系1，廣州 510632)

(江南大學(xué)食品學(xué)院2，無(wú)錫 214122)

大豆卵磷脂中腦苷脂類物質(zhì)的分離純化研究

韓 雪1汪 勇1胡長(zhǎng)鷹1王麗麗1劉元法2王興國(guó)2

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系1，廣州 510632)

(江南大學(xué)食品學(xué)院2，無(wú)錫 214122)

腦苷脂(Cerebroside，Cer)是動(dòng)植物組織內(nèi)主要的鞘脂類(Sphingolipids，SL)物質(zhì)，具有一定的生理活性。以大豆卵磷脂(Lecithin)為主要原料，用石油醚萃取大豆卵磷脂中的中性脂質(zhì)，獲得粗腦苷脂類物質(zhì)。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了石油醚萃取分離粗腦苷脂類物質(zhì)的最佳條件為料液比1∶1、提取溫度50℃，提取時(shí)間30 min，在此條件下得到6．58%的粗腦苷脂。粗腦苷脂用硅膠柱層析分離純化，采用氯仿/甲醇溶劑體系梯度洗脫。通過(guò)二次柱層析，分離得到了高純度的腦苷脂類物質(zhì)。

大豆卵磷脂 腦苷脂 神經(jīng)酰胺 硅膠柱層析

腦苷脂最初是從腦組織中提取出來(lái)的，故稱腦苷脂。在大豆中發(fā)現(xiàn)的腦苷脂主要是葡糖苷脂鞘氨醇，包含一個(gè)葡萄糖分子［1－2］，它是由鞘氨醇、脂肪酸和D－半乳糖所組成，脂肪酸和鞘氨醇的氨基結(jié)合，鞘氨醇C－1上的OH基與D－半乳糖上的β－OH基結(jié)合成β－糖苷鍵。根據(jù)脂肪酸碳鏈中是否含有羥基分成非羥基脂肪酸(Nonhydroxy fatty acid，NHFA)和羥基脂肪酸(Hydroxy fatty acid，HFA)。鞘氨醇有3種結(jié)構(gòu)，含有不飽和雙鍵的鞘氨醇稱為神經(jīng)鞘氨醇(Sphingosine)，飽和的鞘氨醇稱為二氫神經(jīng)鞘氨醇(Sphinganine)，含有4個(gè)羥基的鞘氨醇稱為植物鞘氨醇(Phytosphingosine)［3］。由于腦苷脂是由親水性的糖和親脂性的神經(jīng)酰胺結(jié)合而成，這種結(jié)構(gòu)使之成為生物膜的重要脂質(zhì)組分之一［4］。據(jù)研究報(bào)道，腦苷脂具有抗腫瘤［5］、抗病毒［6］、抗?jié)儯?］、免疫調(diào)節(jié)等作用［8］，可望開(kāi)發(fā)成為防治慢性疾病的新藥。另外腦苷脂對(duì)毛發(fā)還具有保濕作用，因此還可以作為護(hù)膚和護(hù)發(fā)產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)［9］。

由于腦苷脂類化合物在動(dòng)植物組織中含量較少，一般質(zhì)量分?jǐn)?shù)為萬(wàn)分之二左右，因此提取純化較為困難。Kawatake等［10］從斑砂海星中分離出6個(gè)腦苷脂組分的，并鑒定了其結(jié)構(gòu)。Yamada K等［11］從虎紋海參中分離出葡糖腦苷脂，并確定其結(jié)構(gòu)。以上兩人都是用氯仿甲－醇提取，再用乙酸乙酯－正丁醇萃取，用冷丙酮洗滌，得到丙酮不溶物。魏靜等［12］分析測(cè)定了不同提取溶劑對(duì)魔芋飛粉中神經(jīng)酰胺提取效果的影響，比較了氯仿甲醇混合液和95%乙醇的提取率。由于原料昂貴，成本高，不適合用于食品、化妝品和醫(yī)療行業(yè)中鞘脂類的大規(guī)模工業(yè)化提取生產(chǎn)。

Wang等［13］分析了大豆種子不同生長(zhǎng)階段的鞘脂類含量。由于腦苷脂在農(nóng)產(chǎn)品中的含量較低，如要獲得高純度的腦苷脂產(chǎn)品，需要消耗較多的原料，提取腦苷脂后的原料的綜合利用直接關(guān)系到經(jīng)濟(jì)效益。大豆卵磷脂是大豆油加工過(guò)程中的副產(chǎn)品，含有0．1% ～0．5%左右的腦苷脂，是一般農(nóng)產(chǎn)品含量的10倍以上，是制備腦苷脂的理想原料［14－15］，提取腦苷脂后的卵磷脂原料可以回收利用，因此從大豆卵磷脂中提取腦苷脂類化合物具有較大工業(yè)化意義。本試驗(yàn)主要研究利用石油醚萃取去除大豆卵磷脂中的中性脂質(zhì)，得到粗腦苷脂，粗腦苷脂再經(jīng)過(guò)硅膠柱層析進(jìn)行分離純化得到高純度的腦苷脂類物質(zhì)。

1 材料和方法

1．1 試驗(yàn)材料與試劑

大豆卵磷脂:中糧東莞中谷油脂有限公司;柱層析硅膠(100～200目):青島海洋化工廠分廠;硅膠板:煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所;石油醚、甲醇、氯仿、無(wú)水乙醇、硫酸:均為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1．2 試驗(yàn)儀器

RE－52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海嘉鵬科技有限公司;SHZ－D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵:鞏義英峪予華儀器廠;DT5－4型高速離心機(jī):北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;JB50－D型電磁攪拌器:上海滬西分析儀器廠;DHG－9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海恒一科技有限公司;層析柱(20 cm×40 cm):上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 粗腦苷脂的提取

粗腦苷脂的提取分為單因素和正交試驗(yàn)。單因素試驗(yàn)考察提取時(shí)間、提取溫度和料液比3個(gè)因素對(duì)粗腦苷脂得率的影響。粗腦苷脂提取L9(34)正交試驗(yàn)安排見(jiàn)表1，每個(gè)試驗(yàn)做3次平行試驗(yàn)。

提取步驟如下:稱取大豆卵磷脂30．0 g于250 mL的磨口三角瓶中，加入石油醚，連接直型冷凝管，在磁力攪拌下攪拌提取一定時(shí)間。提取結(jié)束后，冷卻。將提取液轉(zhuǎn)讓離心管中，在3 000 r/min下離心10 min，傾倒出石油醚溶液，離心管下層固體為粗腦苷脂，稱重，粗腦苷脂得率=粗腦苷脂質(zhì)量/大豆卵磷脂質(zhì)量×100%。

表1 從大豆卵磷脂中粗腦苷脂提取正交試驗(yàn)因素水平表

1．3．2 粗腦苷脂的預(yù)處理

離心得到的粗腦苷脂再用石油醚萃取一次除去多余的中性脂質(zhì)，得到的褐色粉末狀不溶物再用熱乙醇萃取3次，收集3次萃取液真空濃縮蒸干，得柱分離所需的粗腦苷脂。

1．3．3 腦苷脂柱層析純化

稱取30．0 g硅膠用洗脫劑浸泡，調(diào)成糊狀，勻漿濕法裝柱，靜置過(guò)夜，使硅膠沉降。進(jìn)樣前，用洗脫劑以一定流速淋洗層析柱使之達(dá)到平衡狀態(tài)。稱取0．50 g濃縮蒸干的腦苷脂用少量氯仿完全溶解后小心倒入硅膠柱中，以氯仿/甲醇混合液為流動(dòng)相，在梯度洗脫的條件下對(duì)腦苷脂有很好的分離。柱層析流速控制在1．20 mL/min，用50 mL的小瓶收集洗脫液。在洗脫過(guò)程中用薄層層析(TLC)檢測(cè)各個(gè)洗脫出的樣品，用50%的硫酸顯色，以確定含有腦苷脂的小瓶。收集洗脫液，蒸干溶劑計(jì)算得率和回收率。

一次柱層析得到的組分3和組分4，再上硅膠柱二次層析分離。用氯仿/甲醇(體積比)為100∶1、50∶1、100∶3、25∶1、20∶1、15∶1 和 10∶1 各 100 mL 洗脫，收集液通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)，合并主要成分相同的洗脫液，順次得到3個(gè)主要成分。

1．3．4 薄層板(TLC)分析［16］

所得樣品點(diǎn)樣，放入層析缸中，用氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4)展開(kāi)。當(dāng)展開(kāi)劑前緣距硅膠板上端1 cm處，取出硅膠板吹干，用50%的硫酸均勻噴濕層析板，然后將板放入135℃的烘箱中，10 min后取出，可見(jiàn)清晰的碳化斑點(diǎn)。

2 結(jié)果和討論

2．1 粗腦苷脂的提取

2．1．1 提取時(shí)間

在大豆卵磷脂中，微量的腦苷脂類物質(zhì)溶解在以磷脂和中性脂質(zhì)為主體的體系中。由于腦苷脂類等神經(jīng)鞘脂類物質(zhì)極性較大，在石油醚中溶解度很低，而磷脂、三酰甘油以及脂肪酸等中性油脂可以溶解在石油醚中，因此可以采用石油醚等非極性溶劑從大豆卵磷脂中分離腦苷脂物質(zhì)。向卵磷脂中添加石油醚溶劑時(shí)，溶解在卵磷脂中的腦苷脂物質(zhì)由于溶解度低，而結(jié)晶析出。通過(guò)離心的方法可將結(jié)晶的腦苷脂物質(zhì)分離出來(lái)。離心得到的粗腦苷脂的質(zhì)量可以用來(lái)衡量提取分離的效果。

提取時(shí)間對(duì)粗腦苷脂得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。從理論上講，提取的時(shí)間越長(zhǎng)，粗腦苷脂的得率也越高，因?yàn)槟X苷脂類物質(zhì)結(jié)晶更完全。但是當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)30 min后，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，得率增加趨于平緩，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)60 min后，得率反而降低。粗腦苷脂類物質(zhì)的在非極性溶劑中結(jié)晶需要一定的時(shí)間，時(shí)間過(guò)短，結(jié)晶的物質(zhì)顆粒太細(xì)，離心時(shí)不進(jìn)入沉淀，得率較低。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，粗腦苷脂類物質(zhì)的得率增加。但是當(dāng)提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，由于磷脂是表面活性劑，具有增溶作用，使得粗腦苷脂類物質(zhì)在石油醚中的溶解度增加，降低了得率。

圖1 提取時(shí)間對(duì)粗腦苷脂得率的影響

2．1．2 料液比

測(cè)定了不同料液比對(duì)大豆卵磷脂中腦苷脂提取效果的影響，其測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，隨著料液比的增加，腦苷脂粗提物的含量逐漸降低，料液比在1∶1時(shí)的得率與其他相比有明顯的最高。當(dāng)料液比增加時(shí)，也就是石油醚的比例增加。雖然腦苷脂類物質(zhì)在石油醚中溶解度較低，但是增加溶劑的比例肯定會(huì)增加粗腦苷脂類物質(zhì)在石油醚中的溶解量，降低了得率。

圖2 料液比對(duì)粗腦苷脂得率的影響

2．1．3 提取溫度

測(cè)定了不同提取溫度對(duì)大豆卵磷脂中粗腦苷脂提取效果的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，腦苷脂類化合物的得率在一定溫度范圍內(nèi)(30～45℃)得率略有升高。但是隨著溫度繼續(xù)上升，粗腦苷脂得率反而下降。這是因?yàn)樘崛囟冗^(guò)高時(shí)，有利于提高溶劑的溶解性，使得腦苷脂類物質(zhì)在石油醚中的溶解度提高，從而降低了得率。

圖3 提取溫度對(duì)粗腦苷脂得率的影響

2．2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)一個(gè)3因素3水平的試驗(yàn)如表1。確定石油醚提取腦苷脂的最佳工藝參數(shù)。以料液比，提取溫度和提取時(shí)間為考察因素，以粗腦苷脂得率為指標(biāo)，選用正交表L9(34)對(duì)提取工藝進(jìn)行研究，所得數(shù)據(jù)用正交設(shè)計(jì)助手軟件處理，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 從大豆卵磷脂中粗腦苷脂提取正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)

表3 方差分析表

由表3可以看出，乙醚提取腦苷脂工藝中，料液比對(duì)腦苷脂含量有顯著影響，而提取溫度的影響最不顯著。通過(guò)正交試驗(yàn)可以知道石油醚提取粗腦苷脂的最優(yōu)條件是料液比1∶1、提取溫度50℃下提取時(shí)間30 min。在此條件下，大豆粗腦苷脂的得率為6．58%。

2．3 粗腦苷脂的預(yù)處理

粗腦苷脂預(yù)處理的目的是用石油醚進(jìn)一步除去中性脂質(zhì)(磷脂、甘油酯和脂肪酸)，同時(shí)利用腦苷脂等極性脂質(zhì)溶解于熱乙醇的特性，而一些大極性的低聚糖不溶于乙醇等特性，用乙醇進(jìn)一步富集粗腦苷脂。石油醚結(jié)晶獲得的粗腦苷脂的得率為6．58%，再次用石油醚萃取后得率為0．99%(以大豆卵磷脂重量計(jì)算)。說(shuō)明最佳條件下石油醚結(jié)晶，雖然得率很高，但是其主要成分還是中性脂質(zhì)，第2次石油醚萃取可以較好的去除這些中性脂質(zhì)。脫脂的粗腦苷脂通過(guò)熱乙醇溶解富集，得到的上層析柱的腦苷脂得率為0．25%(以大豆卵磷脂重量計(jì)算)。由于大豆卵磷脂為國(guó)產(chǎn)原料，含有較多的乙醚不溶物(機(jī)械雜質(zhì))，熱乙醇萃取的目的是去除腦苷脂類物質(zhì)中的機(jī)械雜質(zhì)，以便于進(jìn)一步分離純化。

2．4 硅膠柱層析法純化粗腦苷脂

稱取預(yù)處理后的腦苷脂0．50 g用少量氯仿溶解后緩慢倒入層析柱內(nèi)，用不同極性洗脫劑洗脫。因?yàn)榇帜X苷脂是從含中性脂35%左右的大豆卵磷脂中提取的，粗腦苷脂中含有較多的甾醇類、甘油酯等極性較低的中性脂。先用中低極性的溶劑正己烷和氯仿各500 mL洗硅膠柱，除去這些低極性的物質(zhì)。然后依次用不同濃度的氯仿/甲醇溶液各300 mL梯度洗脫(氯仿∶甲醇為100∶1、50∶1、100∶3、25∶1、20∶1、15∶1、10∶1)，極性梯度由低到高，可使不同極性的物質(zhì)按照極性從小到大被洗出來(lái)。通過(guò)薄層層析監(jiān)測(cè)洗脫液的組成，將組成相近的洗脫液合并收集并濃縮蒸干和稱重，得到7個(gè)較純的組分。各收集洗脫液的體積比以及各組分的質(zhì)量比率數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，除組分7外，其他各組分質(zhì)量比率都超過(guò)了10%。

表4 收集液中各組分比率

各個(gè)收集組分通過(guò)硫酸顯色的TLC圖見(jiàn)圖4，可以根據(jù)顏色的不同區(qū)分其主要成分，其中鞘脂類顯紫羅蘭色、磷脂類顯黃色、其他糖酯及碳水化合物顯淡藍(lán)色。從圖4上可以看出，雖然采用石油醚萃取脫中性脂以及熱乙醇預(yù)處理，從大豆卵磷脂中得到的粗腦苷脂其主要成分和卵磷脂類似，只是各種成分含量發(fā)生了變化。而預(yù)處理不溶于乙醇的部分幾乎不含有效成分，主要成分為機(jī)械雜質(zhì)和一些難溶解的粘液質(zhì)物質(zhì)。另外也說(shuō)明，單純的溶劑萃取不能獲得高純度的目標(biāo)物質(zhì)，必需通過(guò)柱層析的方法才可以將各種成分進(jìn)行分離純化。通過(guò)參考文獻(xiàn)［16］可知從TLC圖從溶劑前沿到點(diǎn)樣點(diǎn)順序，主要成分分別為中性脂，甾醇類、Cer、Ce、PE(Phosphatidylethanemine，磷脂酰乙醇胺)、PC(Phosphatidylcholine，磷脂酰膽堿)、LPC(Lyso － Phosphatidylcholine，溶血磷脂酰膽堿)、碳水化合物。

表5 二次過(guò)柱后收集液中各組分比率

除了組分3和組分4以外，其他各組分大多只有一個(gè)點(diǎn)，純度較高。組分1和組分2是中性脂質(zhì)組分，顯色呈黃褐色，其他各組分的最前端為展開(kāi)劑溶劑前沿。組分3和組分4包含本研究的目標(biāo)產(chǎn)物腦苷脂和附加值很高的神經(jīng)酰胺，由于腦苷脂和神經(jīng)酰胺極性差別較小，一次柱層析分離不徹底。將組分3和組分4得到的干物質(zhì)合并，用氯仿溶解后合并再過(guò)一次硅膠柱，用氯仿/甲醇(氯仿∶甲醇為 100∶1、50∶1、100∶3、25∶1、20∶1、15∶1、10∶1)各100 mL 洗脫，收集液通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)，合并主要成分相同的洗脫液，順次得到3個(gè)主要成分，如圖5所示，組分1和組分2前端為溶劑前沿。各收集洗脫液的體積比以及各組分的質(zhì)量比率數(shù)據(jù)見(jiàn)表5，可以看出組分1為Cer，組分2為Ce，組分3基本為洗脫劑，說(shuō)明大部分物質(zhì)在組分1和組分2中，組分4為PC。

3 結(jié)論

3．1 采用石油醚提取濃縮大豆磷脂中的粗腦苷脂，正交試驗(yàn)確定石油醚提取腦苷脂的最優(yōu)條件是料液比1∶1、提取溫度為50℃下提取時(shí)間30 min，粗腦苷脂的得率為6．58%。經(jīng)過(guò)石油醚二次萃取和熱乙醇溶解等預(yù)處理后粗腦苷脂的得率為0．25%。

3．2 采用硅膠柱層析，以氯仿/甲醇為洗脫劑，梯度洗脫純化腦苷脂類物質(zhì)，通過(guò)TLC檢測(cè)洗脫液成分。通過(guò)二次柱層析，可以得到高純度的腦苷脂和神經(jīng)酰胺物質(zhì)。

［1］Vesper H E，Schmelz M Z．Sphingolipids in food and the emerging importance of sphingolipids to nutrition［J］．Nutrition，1999，129:1239 －1250

［2］Sullards M C，Lynch D V，Merrill A H，et al．Structure determination of soybean and wheat glucosylceramides by tandem mass spectrometry［J］．Journal of Mass Spectromtry，2000，35:347－353

［3］Iwamori M，Costello C，Moser H．Analysis and quantization of free ceramide containing nonhydroxy and 2－h(huán)ydroxy fatty acids and phytosphingosine by high performance liquid chromatography［J］．Journal of Lipid Research，1979，20:86 －96

［4］劉圣紅，茍萍．鞘脂類的研究進(jìn)展［J］．生物技術(shù)，2009，19:96－98

［5］Fattorusso E，Mangoni A．Progress in the chemistry of natural products［J］．New York Springer Wien，1997，72:215 －301

［6］劉曉軍，吳梧桐．腦苷脂的制備及其抗?jié)兓钚匝芯浚跩］．藥物生物術(shù)，1995，2:19 －23

［7］Jin W Z，Kenneth L R，Elizabeth A．Ophidiacerebrosidescytotoxic glycosphingolipids containing a novel sphingosine from a sea star［J］．Journal of Organic Chemistry，1994，59:44－147

［8］Natori T，Morita M，Akrmoto K，et al．Agelasphins，novel antitumor and immunostimulatory cerebrosides from the marine sponge A gelas Mauritianus［J］．Tetrahedrom，1994，50(9):2771－2784

［9］桑已曙，閔知大．腦苷脂類化合物研究進(jìn)展［J］．中國(guó)生化藥物雜，2000，21:211 －213

［10］Yamada K，Sasaki K，Harada R，et al．Constituents of holothuroidea，12．isolation and structure of glucocerebrosides from the sea cucumber holothuria pervicax［J］．Chemical ＆Pharmaceutical Bulletin，2002，50:1467 －1470．

［11］Kawatake S，Nakamura K，Inagaki M，et al．Isolation and structure determination of six glucocerebrosides from the starfish Luidia maculata［J］．Chemical＆ Pharmaceutical Bulletin，2002，50(8):1091 －1096．

［12］魏靜，鐘耕，屈浩亮．超聲波法提取魔芋飛粉中神經(jīng)酰胺的初步研究［J］．食品科技，2008，1:146－150．

［13］Wang L P，Wang T，F(xiàn)ehr W R．Effect of seed development stage on sphingolipid and phospholipid contents in soybean seeds［J］．Journal of Agriculture and Food Chemistry，2006，54:7812 －7816

［14］Wang L P，Wang T，F(xiàn)ehr W R．HPLC quantification of sphingolipids in soybeans with modified palmitate content［J］．Journal of Agriculture and Food Chemistry，2006，54:7422－7428

［15］Gutierrez E，Wang T，F(xiàn)ehr W R．Quantification of sphingolipids in soybeans［J］．Journal of the American Oil Chemists＇Society，2004，81:737 －742

［16］Patrick LS，Peter K．Molecular structure and baking performance of individual glycolipid classes from lecithins［J］．Journal of Agriculture and Food Chemistry，2009，57:5597 －5609．

Study on Separation and Purification of Cerebrosides from Soybean Lecithin

Han Xue1Wang Yong1Hu Changying1Wang Lili1Liu Yuanfa2Wang Xingguo2

(Department of Food Science and Engineering，Jinan University1，Guangzhou 510632)
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University2，Wuxi214122)

Cerebrosides(Cer)are the predominant sphingolipids(SL)in the tissues of animals and plants with certain biological activity．In this study，soybean lecithin was used as raw material to extract neutral lipids by petroleum ether to obtain the crude cerebrosides．The optimal conditions for extraction obtained by the single factor experiments and the orthogonal experiments were listed as follows:ratio of solvent to stuff of 1∶1，extraction temperature of 50 ℃and extraction time of 30 min．Under these conditions，the highest yield of the crude cerebrosides was 6．58%．The crude cerebrosides were separated and purified by a silica gel column chromatography and gradiently eluted by chloroform/methanol solvent mixture．Cerbrosides with a high purity were obtained by the second column chromatography purification．

soybean lecithin，cerebrosides，ceramide，silica gel column chromatography

TS227

A

1003－0174(2011)03－0011－05

863計(jì)劃(2010AA101505)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(21610501)

2010－04－28

韓雪，女，1984年出生，碩士，食品科學(xué)

汪勇，男，1977年出生，副研究員，碩士生導(dǎo)師，糧食、油脂及植物蛋白工程