陸美斌 李為喜 武 力 王步軍

(中國農業(yè)科學院作物科學研究所農業(yè)部谷物品質監(jiān)督檢驗測試中心，北京 100081)

HPLC測定谷物中玉米赤霉烯酮的不確定度評定

陸美斌 李為喜 武 力 王步軍

(中國農業(yè)科學院作物科學研究所農業(yè)部谷物品質監(jiān)督檢驗測試中心，北京 100081)

依據(jù)JJF 1059—1999《測量不確定度評定與表示》和JJF 1135—2005《化學分析中不確定度評定》原理及方法，通過分析谷物中玉米赤霉烯酮的測定過程，確定各個不確定度來源，建立不確定度評定數(shù)學模型，對單個不確定度分量進行合成和擴展，最終建立高效液相色譜法測定谷物中玉米赤霉烯酮的不確定度評定方法。結果表明:玉米赤霉烯酮含量=(57．82±2．67)μg/kg，K=2。測量不確定度的主要來源為4個方面，按引入的不確定度分量貢獻大小排序，依次為溶液測定、測量重復性、樣品定容、稱樣量。

高效液相色譜法 玉米赤霉烯酮 不確定度

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)又稱F－2毒素，是主要由鐮刀菌產生的2，4一二羥基苯甲酸內酯類化合物，它是糧食安全衛(wèi)生的重要理化指標。目前許多國家對玉米赤霉烯酮含量都有嚴格規(guī)定，我國《糧食衛(wèi)生標準》(GB 2715—2005)也明確要求小麥、玉米中玉米赤霉烯酮含量不能超過60 μg/kg［1］。在分析測試領域中，有效評定玉米赤霉烯酮測量結果質量顯得尤為重要。不確定度作為一種科學方法，是實驗室工作的重要質量指標，測量結果的可用性很大程度上取決于不確定度的大小。鑒于目前國內幾乎沒有玉米赤霉烯酮測量不確定度研究的報道，本研究參照國家標準GB/T 5009．209—2008《谷物中玉米赤霉烯酮的測定》［2］，以玉米為例，對谷物中玉米赤霉烯酮的測定進行分析評定，建立液相色譜法測定谷物中玉米赤霉烯酮的不確定度評定方法，以期為正確評價和使用檢測數(shù)據(jù)提供科學的依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑與儀器

樣品來源及處理:2009年大田玉米，晾干，手工脫粒，粉碎(20目)。

甲醇(HPLC級)、乙腈(HPLC級):美國Fisher公司;氯化鈉:北京化工廠;玉米赤霉烯酮免疫親和柱:美國Vicam公司;玻璃纖維濾紙:美國Whatman公司、玉米赤霉烯酮標準品(Z2125－10MG):日本Sigma公司。除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為高純水。

LC－20AB高效液相色譜儀配有熒光檢測器:日本Shimadzu公司;1093型粉碎機:瑞典 Vetcator公司;T18 basic均質機:德國IKA公司;BF－2000M型氮吹儀:北京八方世紀科技有限公司;ACO－5503型超靜強力氣泵:廣東海利集團有限公司;玻璃注射器(20 mL):北京中檢維康技術有限公司;1702型電子天平(感量0．1mg):西德Sartorius公司。

1．2 測量原理與方法

1．2．1 測量原理

試樣中玉米赤霉烯酮用乙腈－水提取，提取液經免疫親和柱凈化、濃縮后，用配有熒光檢測器的液相色譜儀進行測定，外標法定量。

1．2．2 測定過程

稱取樣品40 g，置于250 mL具塞三角瓶中，加入4 g氯化鈉和100 mL乙腈－水(9+1)，高速攪拌提取2min，用折疊快速定性濾紙過濾，移取10．0 mL濾液并加入40 mL水稀釋均勻，經玻璃纖維濾紙過濾1～2次，至濾液澄清。將免疫親和柱連接20 mL玻璃注射器。準確移取10 mL提取濾液，注入玻璃注射器中，連接空氣壓力泵與玻璃注射器，調節(jié)壓力使溶液以1～2滴/s的流速緩慢通過免疫親和柱，直至有部分空氣通過柱體。以5 mL水淋洗柱子1次，棄去全部流出液，并使部分空氣通過柱體。準確加入1．5 mL甲醇洗脫，流速為1 mL/min，手機洗脫液于玻璃試管，55℃以下氮氣吹干，用1．0 mL流動相溶解殘渣，供液相色譜測定。同時做空白試驗。

1．2．3 工作曲線繪制

0．1 mg/mL玉米赤霉烯酮標準溶液配制:準確稱取10 mg玉米赤霉烯酮標準品，用乙腈溶解定容至100 mL。由0．1 mg/mL玉米赤霉烯酮標準溶液用流動相逐級稀釋配置成200、100、50、20、10 ng/mL 系列標準溶液。以空白作參比，同測量步驟選定的儀器條件測定峰面積。以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制工作曲線。

1．3 數(shù)據(jù)處理

利用極差法、最小二乘法等統(tǒng)計方法計算分析，使用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2．1 數(shù)學模型

根據(jù)測定原理及方法，測定結果和有關參數(shù)有如下函數(shù)關系:

式中:X為試樣中玉米赤霉烯酮含量/μg/kg;c為由標準曲線得到的試樣溶液中玉米赤霉烯酮的濃度/ng/mL;V為樣品最終定容體積/mL;m為樣液代表的試樣量/g;rec為回收率校正因子，由添加回收試驗所得，表示測量結果系統(tǒng)偏差的參數(shù);rep為總重復性因子，由重復性試驗所得，表示測量結果間一致性的參數(shù)。

從數(shù)學模型看出，各影響參數(shù)相互獨立，各參數(shù)的不確定度直接對被測量X的不確定度產生影響，根據(jù)JJF1135—2005《化學分析中不確定度評定》［3］，合成標準不確定度可用相對標準不確定度進行，公式如下:

2．2 不確定度來源

玉米赤霉烯酮測定的不確定度來源主要包括樣品稱量引入的不確定度、樣品定容體積引入的不確定度、測量用樣品溶液中玉米赤霉烯酮含量引入的不確定度、測量重復性引入的不確定度和分析程序的系統(tǒng)偏差引入的不確定度，因果關系如圖1所示。

樣品稱量引入的不確定度與天平稱量的最大允許誤差和重復性誤差有關;樣品定容體積引入的不確定度與定容用容量瓶、移液器體積、定容溫度與校正溫度不同引起體積變動有關;測量用樣品溶液中玉米赤霉烯酮含量引入的不確定度與擬合標準工作曲線求玉米赤霉烯酮含量、玉米赤霉烯酮標準溶液和配制標準曲線引入的不確定度有關。

圖1 不確定度的因果關系圖

重復性引入的不確定度:分析方法本身的變動性通常難以量化，尤其是復雜的分析過程，很難用技術文件數(shù)據(jù)進行不確定度評定，應盡可能進行重復性實驗，將結果進行量化統(tǒng)計得出不確定度。

分析程序的系統(tǒng)偏差引入的不確定度:分析程序的系統(tǒng)偏差可以通過加標回收試驗進行研究評定。

2．3 不確定度分量評定

2．3．1 樣品稱量引入的不確定度U(m)

根據(jù)天平鑒定證書，其最大允許誤差為0．4 mg，按照矩形分布［1］，引入的不確定度為 0．4÷31/2=0．230 9 mg?？紤]到天平有去皮操作，稱量一次引入的標準不確定度 U(m)為21/2×0．230 9=0．326 5 mg。相對標準不確定度Urel(m)=U(m)÷m=0．326 5 mg÷40 g=8．16 ×10－6。

2．3．2 定容體積引入的不確定度U(V)

按照 JJG646—2006《移液器檢定規(guī)程》［4］和相關產品證書，用最大允差計算不確定度，假設為三角分布(表1)。

合成相對標準不確定度 Urel(V)=［(3．54×10－3)2+(6．94 ×10－4)2+(2．04 ×10－3)2+(2．04 ×10－3)2］1/2=4．62 ×10－3。

表1 樣品定容引入的不確定度

試驗室環(huán)境溫度一般為20℃，由于溫度波動引起的液體體積膨脹導致的不確定度忽略不計。

2．3．3 測定樣品溶液中玉米赤霉烯酮含量引入的不確定度U(c)

2．3．3．1 擬合標準工作曲線求玉米赤霉烯酮含量引入的不確定度

乙腈溶解玉米赤霉烯酮標準品配制成0．1 mg/mL標準儲備液，使用前用流動相稀釋成適當質量濃度標準工作溶液，進行2次重復測定，結果如表2所示。

表2 標準工作曲線測定結果

根據(jù)表2結果，用線性最小二乘法［3］擬合校準曲線，得回歸方程Y=814．0X－810．4，相關系數(shù)r=0．999 96，記為 Y=BX+A，其中 B=814．0，A=－810．4。對測定用樣品溶液中玉米赤霉烯酮含量進行 2 次測定，結果分別為 44．65、47．87 ng/mL，平均值為46．26 ng/mL。

C的標準不確定度由下式［2］可得:

從計算公式可以看出，樣品溶液濃度偏離標準工作曲線濃度平均值越大，不確定度就越大，與平均值相等情況下，不確定度值最小。這是由線性最小二乘法本身所決定的。在試驗過程中應選擇適當濃度梯度的標準工作曲線，有利于減小由此引入的不確定度。

2．3．3．2 配制玉米赤霉烯酮標準工作曲線引入的不確定度

用乙腈溶解10 mg玉米赤霉烯酮標準品定容于100 mL容量瓶，配制成0．1 mg/mL玉米赤霉烯酮標準儲備液。玉米赤霉烯酮標準品證書未提供不確定度信息，假定其不確定度為0．100 mL，容量瓶最大允差為 ± 0．01 mL［5］，按照三角分布計算不確定度0．01÷61/2=0．004 08 mL，相對標準不確定度為0．004 08 ÷100=4．08 ×10－5。0．1 mg/mL 玉米赤霉烯酮標準儲備液相對標準不確定度為［(4．08×10－5)2+(0)2］1/2=4．08 ×10－5。

分別移取5、10、25、50、100 μL 至50 mL 容量瓶，定容，此溶液為玉米赤霉烯酮標準工作溶液。按照JJG 646—2006［4］和 JJG 196—2006［5］，用最大允差計算不確定度，假設為三角分布(表3)。合成相對標準不確定度為［(1．22 × 10－2)2+(4．08 × 10－3)2+(2．04 ×10－3)2+(2．45 ×10－3)2+(6．12 ×10－3)2+(9．13 ×10－4)2］1/2=1．47 ×10－2。

表3 配制標準工作曲線時量器校準引入的不確定度

由表3數(shù)據(jù)得出相對標準不確定度為［(4．08×10－5)2+(1．47 ×10－2)2］1/2=1．47 ×10－2。

2．3．3．3 配制過程溫度變化產生的不確定度

實驗室溫度控制嚴格，一般為20℃，波動很小，由此引入的不確定度忽略不計。

2．3．3．4 合成相對標準不確定度

測定樣品溶液中玉米赤霉烯酮含量引入的相對標準不確定度 U(c)=［(1．25 ×10－2)2+(1．47 ×10－2)2］1/2=1．93 ×10－2。

2．3．4 測量重復性引入的不確定度U(rep)

在重復性條件下，對同一樣品進行5次獨立觀測，測量結果分別為 56．86、58．94、57．79、56．70、58．8 μg/kg，5 次測量的平均值為 57．82 μg/kg，用極差法［6］求得不確定度為 2．24 ÷ 2．33 ÷21/2=0．68 μg/kg，相對標準不確定度為 U(rep)=0．68 ÷57．82=1．18 ×10－2，其中 2．33 為極差系數(shù)。

不確定度評定中應盡可能進行重復試驗，以取得包括化學反應過程(如本試驗中的提取凈化過程等)和各測量變動性在內的重復性數(shù)據(jù)。評定了測量重復性分量，則儀器本身的變動性、器皿和天平讀數(shù)等的重復性不必再評定。一般情況下，重復性的不確定度分量貢獻較大，不容忽視。本研究將空白引入的不確定度放入到重復性引入的不確定度中一并考慮。

2．3．5 分析程序的系統(tǒng)偏差引入的不確定度U(rec)

進行加標回收試驗，添加水平為50 μg/kg，11個樣品的平均回收率為97．9%，標準偏差4．1%，標準不確定度采用平均值的標準偏差。U(rec)=4．1% ÷(11)1/2=1．24 ×10－2，Urel(rec)=1．24 ×10－2÷97．9%=1．26×10－2。顯著性檢驗是用來確定平均回收率與期望值1是否存在顯著性差異［7］:1．694≤tcrit，10=2．228，其中 t是自由度為10時的雙邊臨界值，結果表明差異不顯著。所以該方法不存在系統(tǒng)偏差，公式中不需要加入校正因子1/rec。不確定度評定的數(shù)學模型修正為:Ur2(X)

若顯著性檢驗結果為存在顯著性差異，則結果需要用回收率校正因子進行修正，且在不確定度評定過程中應考慮系統(tǒng)偏差引入的不確定度分量。

2．4 合成標準不確定度

將各個相對標準不確定度分量(見表4)進行合成，則合成相對標準不確定度為 Ucrel(X)=［(8．16×10－6)2+(4．62 ×10－3)2+(1．93 ×10－2)2+(1．18 ×10－2)2］1/2=2．31 ×10－2。

表4 相對標準不確定度一覽

2．5 擴展不確定度

取包含因子K=2，擴展不確定度U(X)/X=2×Ucrel(x)=4．62 ×10－2。則 U(X)=57．82 ×4．62 ×10－2=2．67 μg/kg。

2．6 不確定度報告

玉米赤霉烯酮含量 =(57．82 ±2．67)μg/kg，K=2。

2．7 不確定度分量統(tǒng)計直方圖

如圖2所示，測量不確定度的主要來源為4個方面(其中m所表示的稱樣量由于數(shù)值相對較小按圖中比例未能顯示出來)，按引入的不確定度分量貢獻大小排序，依次為溶液測定、測量重復性、樣品定容、稱樣量。

圖2 不確定度分量統(tǒng)計直方圖

3 結論

液相色譜法測定谷物中玉米赤霉烯酮含量，結果表示為玉米赤霉烯酮含量 =(57．82±2．67)μg/kg，K=2。結果符合國標［3］規(guī)定的誤差要求，本次評定合理有效。測量不確定度的主要來源為4個方面，按引入的不確定度分量貢獻大小排序，依次為溶液測定、測量重復性、樣品定容、稱樣量。稱樣引入的不確定度貢獻很小，基本可以忽略。溶液測定引入的不確定度貢獻最大，測定時要引起充分的重視。

［1］GB 2715—2005，糧食衛(wèi)生標準［S］

［2］GB/T 5009．209—2008，谷物中玉米赤霉烯酮的測定［S］

［3］JJF 1135—2005，化學分析中不確定度評定［S］

［4］JJG 646—2006，移液器檢定規(guī)程［S］

［5］JJG 196—2006，常用玻璃量器檢定規(guī)程［S］

［6］JJF 1059—1999，測量不確定度評定與表示［S］

［7］中國試驗室國家認可委員會．化學分析中不確定度的評估指南［M］．北京:中國計量出版社，2002:66．

Uncertainty Evaluation in HPLC Determination of Zearalenone in Cereals

Lu Meibin Li WeixiWu LiWang Bujun

(Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agriculture Sciences，Supervision and Testing Center of Cereal Quality，Ministry of Agriculture，Beijing 100081)

The base of this investigation is the principles and methods of JJF 1059—1999《Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement》and JJF 1135—2005《Evaluation of Uncertainty in Chemical Analysis Measurement》．The sources of uncertainty in determination of zearalenone in cereals by high performance liquid chromatography(HPLC)were established by analyzing the whole determination procedure．Each uncertainty component was modeled，synthesized and expanded to develop an evaluation method of the uncertainty in HPLC determination of zearalenone in cereals．Results:The zearalenone content in cereals determined is(57．82 ± 2．80)μg/kg，K=2．There are four main sources of uncertainty attributed，which rank in decreasing order of uncertainty contribution as solution determination，measurement repeatability，sample dilution，and sampling．

HPLC，zearalenone，uncertainty

O657．71

A

1003－0174(2011)03－0114－05

2009年農業(yè)部無公害農產品質量安全監(jiān)測(2130109)

2010－03－01

陸美斌，女，1979年出生，助理研究員，食品科學與工程

王步軍，男，1960年出生，研究員，博士生導師，農產品質量與安全