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肌注PHA對豬血清中補體C3、C4的影響

肖嘯①* 何克燦②沈學文②張榮華②楊東②(①云南農業(yè)大學動物科學技術學院 昆明 650201 ②云南省紅河州動物疫病預防控制中心 蒙自)

本試驗對各豬只肌注PHA，通過測定不同時期血清中補體C3、C4的濃度，來判定PHA是否對補體有影響作用，并測定有顯著影響的PHA劑量。試驗中，把PHA分成5個劑量組：低劑量組(0.4mg/kg)、中劑量組(0.8mg/kg)、高劑量組(1.2mg/kg)、超高劑量組(1.6 mg/kg)、對照組(0.8mg/kg生理鹽水)進行肌肉注射。各試驗豬均按正常管理、飼喂，并在注射后的第1、7、14d對各組豬只采血，測定其血清中補體的含量。結果顯示，不同劑量的PHA對豬只的補體系統(tǒng)刺激作用不同，其中中劑量組可以提高機體的補體水平，并保持一定時間的高水平，低劑量組的豬只補體水平稍有升高，而高劑量組和超高劑量組則使機體的補體水平有所降低。

豬 植物凝集素 補體C3、C4

植物凝集素(PHA)主要用于激活免疫細胞—淋巴細胞，是一種干擾素誘導劑，不僅可以刺激機體產生白介素-2和干擾素；還可以刺激機體產生非特異性抗體，激活機體的補體系統(tǒng)[9]。PHA的藥理作用[10-11]特別廣泛，其作用機理是機體免疫系統(tǒng)通過識別植物血凝素而識別病毒，并產生相應的抗體和其它免疫反應，從而清除體內病毒。作用主要有：（1）PHA為廣譜抗病毒藥，可刺激T淋巴細胞增殖分化產生大量效應T細胞和細胞毒T細胞，效應T細胞分泌產生大量細胞因子(如干擾素等)殺傷病毒，細胞毒T細胞可直接殺傷病毒。（2）PHA可同時刺激B細胞轉化為漿母細胞后增殖分化為漿細胞，漿細胞產生大量非特異性抗體來中和病毒。（3）PHA可增強機體免疫功能，提高骨髓造血機能，促進機體白細胞及多核白細胞數(shù)量明顯增加；提高機體細胞誘生干擾素，增強機體免疫力，促進抗體形成，增強機體對病原微生物的吞噬作用。（4）PHA與黃芪多糖、左旋咪唑、阿糖腺苷配伍，有明顯的增效作用；與部分抗生素等配伍具有相加作用。（5）PHA在肌肉注射后約5~15min血藥濃度達高峰，口服約1h后血藥濃度達高峰，代謝產物主要從尿液排出。

目前，國內還沒有人做過肌注PHA對豬血清補體C3、C4的影響的研究。所以本試驗通過給豬只肌肉注射不同劑量的PHA，測定不同時期其體內補體C3、C4的含量，并進行生物學統(tǒng)計學分析，從而判定給豬只肌注PHA來增強機體免疫力的最適劑量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 本次試驗所選用30頭豬都由瀘西縣藍天種豬場提供。所選豬只均為65日齡，體重為17~25kg。試驗前對豬進行預防接種疫苗，并確定所選豬均屬健康。試驗前、后均按正常方式飼養(yǎng)，環(huán)境、飼料不變。

1.2.2 試驗藥物 植物凝集素(1mg/ml)，由云南師范大學生命科學院提取。

1.2.3 試驗器材及試劑 檸檬酸鈉真空采血管，江西格蘭斯醫(yī)療器械有限公司，生產批號081009；半自動生化分析儀，華儀器 L-3280，V1.06.0808，儀器序列號：SHB10604044；離心機，北京醫(yī)用離心機廠生產型號LD4-2A。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 選擇的健康豬只30頭，按年齡體重相近似原則對其分組，分成5個組，每組為6頭并將其編號。對照組為01~06號肌注0.8mg/kg的生理鹽水、低劑量組為07~12號肌注PHA的劑量為0.4mg/kg、中劑量組為13~18號肌注PHA的劑量為0.8mg/kg、高劑量組為19~24號肌注PHA的劑量為1.2mg/kg、超高劑量組為25~30號肌注PHA的劑量為1.6mg/kg。肌注部位為：豬耳后3~5cm處。各試驗豬均按正常管理。間隔1周和2周對各組豬只采血分析。

1.2.2 血樣的采集和處理 試驗期為2周，在注射后的第1、7、14d分別采血取樣。用注射器從各豬只的耳靜脈抽取3ml全血，放入檸檬酸鈉真空采血管中保存，于離心機中離心，以4000r/min離心30min，分離血清，取上層血清移入各試劑杯中。

1.2.3 檢測指標 待測血清做生化指標檢測。用半自動生化分析儀檢測待測血清，主要檢測補體C3、C4濃度。

1.2.4 檢測方法 采用免疫比濁測定法。其基本原理是：抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復合物，使反應液出現(xiàn)濁度。當反應液中保持抗體過量時，形成的復合物隨抗原量增加而增加，反應液的濁度亦隨之增加，與一系列的標準品對照，即可計算出受檢物的含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件。全部數(shù)據(jù)采用平均值對比(圖表比較)和F檢驗與q檢驗(結果用均數(shù)±標準差)表示。標準差用α表示。

2 試驗結果

測得每頭豬的補體C3、C4水平的數(shù)據(jù)見表1。由表1資料總結出表2和表3并作出折線圖1。從表3中明顯可見中劑量組的PHA對豬只免疫增強有非常好的效果，補體C3、C4水平達到了高峰，第14天與第1、7天相比補體C3、C4有顯著提高(P<0.05)。

表1 不同時期補體C3、C4的含量 (mg/L)

從表1可見，每1頭豬所在不同時期測出的補體C3、C4的量有所不同。

表2 不同時期補體C3、C4平均數(shù)比較 (mg/L)

對照組 低劑量組 中劑量組 高劑量組 超高劑量組

由表1、2、3可知，與對照組相比，在給豬只注射了4個劑量組的PHA，在經過1周時間之后，每頭豬的補體C3、C4都有了不同程度的提高或降低，主要原因是由不同劑量的PHA和豬個體差異所引起的。但是中劑量組呈明顯提高的趨勢，達到9.90%(C3)和9.53%(C4)的提高率，低劑量組為2.29%(C3)和2.38%(C4)，高劑量組為-1.82%(C3)和-2.81%(C4)，超高劑量組為-5.18%(C3)和-5.47%(C4)。然而在2周之后測量時，中劑量組仍保持在較高的水平，為原來的5.11%(C3)和9.11%(C4)，低劑量組有所提高為1.74%(C3)和2.43%(C4)，高劑量組和超高劑量組卻低于原來的水平，分別為-1.78%(C3)，-2.88%(C4)和-4.81(C3)和-2.76(C4)。另外，對照組補體C3、C4的含量也有一定的變化，但相對其它4個試驗組，變化不明顯。

表3 補體C3、C4數(shù)目分析，結果用(均數(shù)±標準差) (mg/L)

注：表中列數(shù)字右肩字母不同者，表示差異顯著(P<0.05)

由表3可知，對照組的C3、C4的差異不顯著(P>0.05)。相對于其它劑量組，中劑量組的PHA差異顯著(P<0.05)，而低劑量組、高劑量組和超高劑量組的差異不顯著(>0.05)。

3 討論

3.1 PHA的生物學功效 植物凝集素是利用國際先進的超低溫冷凍技術從紅蕓豆中提取的一種物質，由D－甘露糖、氨基酸葡萄糖酸衍生物所構成的低聚糖輔基與蛋白質復合物。植物凝集素對機體毒副作用小，具有刺激細胞增殖、活化，增強免疫低下患者的免疫功能，抑制腫瘤生長等生物學功效[1]。植物中，不僅種子中存在凝集素，根、莖、葉、皮、果實中也發(fā)現(xiàn)有凝集素。1888年俄國Dorpt大學的Stillmark首次發(fā)現(xiàn)了蓖麻凝集素。1936年Summer and Howell發(fā)現(xiàn)凝集素專一性結合糖的性質。1960年Nowell報道了植物細胞凝集素有促進有絲分裂的作用。1975年Becker等研究了刀豆凝集素分子的三級結構，揭開了研究植物凝集素分子空間結構和功能的序幕[2]。植物凝集素的定義也已幾經修正，1995年Willy J．Peumans和Els J．M．Van Damme認為確定蛋白質為凝集素的唯一前提條件是至少應有一非結構域，且其能可逆地結合到特異碳水化合物上[3]。

PHA無種屬特異性，具有協(xié)同作用或相加作用，具有明顯提高原有產品療效的作用，同時不干擾原產品的檢測，使用方便，分布廣泛，避免由于加強免疫引起的抗體水平過高及疫苗應激反應。在抗病毒方面具有廣譜、毒性小、安全范圍大等特點。在免疫學領域，植物凝集素是免疫學研究中極其重要的試劑，有著巨大的應用前景。目前，國內外的好多專家學者都對植物凝集素的功能做了深入的研究，認為植物凝集素是自然界廣泛存在的一類能凝集細胞、多糖或糖復合物的非源于免疫反應的糖蛋白，是一種有絲分裂原，主要用于激活免疫細胞即淋巴細胞。他們發(fā)現(xiàn)PHA聚酯有至少125種不同的單體結構，并且新的單體被不斷地發(fā)現(xiàn)出來。由微生物合成的PHA有一些特殊的性能，包括生物可降解性、生物相容性、壓電性和光學活性等。另外，根據(jù)單體結構或含量的不同，PHA的性能可從堅硬到柔軟到彈性變化[4]。

3.2 補體系統(tǒng)的生物學意義 補體(complement,C)是存在于人和動物新鮮血清中具有酶活性的免疫球蛋白，約占血清球蛋白總量的10%。動物血清中的補體系統(tǒng)既是天然免疫的重要組成部分，又在獲得性免疫過程中發(fā)揮重要作用。19世紀末，在研究免疫溶菌和免疫溶血反應中，認為這種球蛋白是對抗體的溶細胞有輔助作用的物質，因而得名補體。補體由9種成分組成，分別命名為C1、C2、C3、…、C9。其中C1又3個亞單位即C1q、C1r和C1s亞單位組成，統(tǒng)稱為補體系統(tǒng)。當存在抗原抗體復合物或其它激活因子時，補體可以被激活。補體活化后在靶細胞膜上形成膜攻擊復合物，導致靶細胞的溶解，這一功能在動物的免疫系統(tǒng)中起重要的防御和免疫監(jiān)視作用，在抗體產生前可抵抗病原微生物的感染，在抗體產生后，起主要的殺滅微生物的作用[5]。補體在體內作用很廣泛，補體結合反應的膜攻擊作用可使某些細菌溶解破壞，喪失致病力。補體反應序列中所產生的各種中間產物有促進炎癥反應、增強吞噬功能，中和病毒和免疫吸附的作用。另外，補體還與血液凝固及蛋白質溶解系統(tǒng)有關[6]。補體極不穩(wěn)定，大部分對熱敏感，56℃30min即失去活性。在哺乳動物體內，細菌性疫苗產生抗體后，當同類病原體再次侵入動物機體時，不僅動物體內的抗體能夠及時地對病原體進行黏附，病原體本身和抗原抗體復合物同時激活補體，對侵入機體的細菌進行殺滅清除，哺乳動物體內補體的活性和數(shù)量較高，能夠較大強度地殺滅細菌予以清除，保護動物健康[7]。

補體系統(tǒng)參與機體的特異性和非特異性免疫機制，表現(xiàn)為抗微生物防御反應，免疫調節(jié)及介導免疫病理的損傷性反應，是機體內一個具有重要生物學意義的效應系統(tǒng)和效應放大系統(tǒng)，而補體C3是補體系統(tǒng)中含量最高的成分。補體系統(tǒng)中補體C3、C4為補體系統(tǒng)中固有的成分，存在于體液中，補體C3 是補體激活過程中起關鍵性作用的一種成分，不論是經典激活途徑還是替代激活途徑，均需在C3 被激活之后，才能推進后續(xù)補體成分的連鎖反應。補體C4 則在經典途徑的活化階段起著重要作用[8]。補體C3、C4是體內一組具有酶原活性的球蛋白，它們在機體防御過程中可通過免疫復合作用、調理吞噬細胞等機制對病原微生物進行清除及活化炎性細胞對靶細胞的殺傷作用。

3.3 PHA可提高機體免疫力 由表2和表3可知，該試驗結果與河南農大的郭爽等人[12]利用植物凝集素在小白鼠上所做的結果有相似之處。在本試驗中給豬肌肉注射不同計量的PHA后，其不同程度的刺激豬機體免疫，使機體補體C3、C4的含量都有不同程度的變化。其中，與對照組相比，在給豬只注射了4個劑量組的PHA，在經過1周時間之后，補體C3、C4都有了不同程度的提高或降低，其中中劑量組提高的最高，低劑量組稍有提高，高劑量組和超高劑量組卻有所降低。在2周之后測量時，中劑量組仍保持在較高的水平，低劑量組也保持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)，高劑量組和超高劑量組還是低于原來的水平。試驗結果說明，給豬只注射不同劑量的PHA之后，在一定時期內能夠提高機體的免疫力，從而保護動物的健康，但不同劑量PHA在對機體作用時有不同的效果，并且在注射后的不同時間，效果也不相同。

PHA可以用于激活免疫細胞，刺激機體產生白介素-2和干擾素，還可以刺激機體產生非特異性抗體，激活機體的補體系統(tǒng)。補體是人或動物體液中正常存在的一組與免疫有關的、具有酶原活性的球蛋白。補體系統(tǒng)廣泛參與機體抗微生物防御反應以及免疫調節(jié)，也可介導免疫病理的損傷性反應，是機體內具有重要生物學意義的效應系統(tǒng)和效應放大系統(tǒng)。而C3、C4為補體系統(tǒng)中固有的成分，存在于體液中。補體系統(tǒng)被活化后，具有溶菌、溶細胞現(xiàn)象，并可促進吞噬細胞的吞噬作用，還可使肥大細胞脫顆粒、釋放組織胺等。導致血管通透性增高、產生炎癥反應。有利于將殺菌因素和吞噬細胞集中到炎癥部位，將免疫復合物清除。

3.4 不同劑量的PHA免疫效果不同 給豬只注射不同劑量的PHA，在不同時期內，機體的補體水平不相同，中劑量組使機體的C3、C4水平提高較高，并在2周后仍保持在相當高的水平。低劑量組的PHA對補體C3、C4水平稍有升高，可能是由于PHA含量較少，雖有對機體刺激使補體C3、C4水平有所提高，但效果不是最明顯的。高劑量組中補體C3、C4下降并低于原來的水平，可能是產生了免疫抑制現(xiàn)象，即抑制非特異性免疫，使體液中補體減少，降低機體抵抗力；抑制特異性免疫，造成淋巴器官萎縮、周圍淋巴細胞減少及功能抑制、抗體形成抑制；抑制免疫監(jiān)視功能。超高劑量組中的補體C3、C4水平也下降了，這也可能是PHA的過量注射而產生了免疫抑制。其中，上述各組均有個別豬只的補體C3、C4在注射PHA后高于或低于原來的水平，這可能是因為試驗動物不是標準的實驗動物、豬只個體水平的差異、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料等因素所導致的。另外，對照組補體C3、C4的含量也有一定的波動，也可能與試驗豬個體特質有關系，由于受外界條件因素的影響，其體內的補體含量本來就不穩(wěn)定，但相對于試驗組，其變化很明顯。

4 結論

通過該試驗，說明對豬使用PHA可以激活機體的補體系統(tǒng)，尤其是刺激機體產生補體C3、C4；5個組補體C3、C4的量不同，說明不同劑量的PHA對豬只的補體系統(tǒng)刺激作用強度不同，其中中劑量組(0.8mg/kg)的PHA可以極大地提高機體的補體水平，并保持一定時間的高水平，低劑量組也有升高，而高劑量組和超高劑量組使機體的補體水平有所下降。在應用PHA時，應注意PHA的質量，謹慎使用，并嚴格注意其用量，以免發(fā)生抑制免疫起不到理想的免疫效果。

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云南省高端科技人才引進計劃項目子項目。項目編號：2009C1125-6。

S852.5+1

A

1007-1733(2011)01-0001-04

（2010–10–31）