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蟾蜍靈激活低分化鼻咽癌細(xì)胞氯通道*

2011-11-20 02:41羅海兵李華榮劉善文劉振鋒葉文才張冬梅陳麗新王立偉
中國(guó)病理生理雜志 2011年4期
關(guān)鍵詞:莫昔芬蟾蜍灌流

羅海兵, 李華榮, 劉善文, 彭 爽, 劉振鋒, 葉文才, 張冬梅, 陳麗新△, 王立偉△

(1廣東醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,廣東 湛江 524023;暨南大學(xué)2醫(yī)學(xué)院, 3藥學(xué)院,廣東 廣州 510632)

蟾蜍靈激活低分化鼻咽癌細(xì)胞氯通道*

羅海兵1, 李華榮2, 劉善文2, 彭 爽2, 劉振鋒2, 葉文才3, 張冬梅3, 陳麗新2△, 王立偉2△

(1廣東醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,廣東 湛江 524023;暨南大學(xué)2醫(yī)學(xué)院,3藥學(xué)院,廣東 廣州 510632)

目的研究蟾蜍靈(bufalin)對(duì)低分化鼻咽癌(CNE - 2Z)細(xì)胞氯通道的激活作用以及通道的特性。方法采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄蟾蜍靈激活CNE - 2Z細(xì)胞膜電流并分析其電流特征。結(jié)果細(xì)胞外灌流1 μmol/L 的蟾蜍靈可誘發(fā)CNE - 2Z細(xì)胞產(chǎn)生一個(gè)氯電流,該電流潛伏期較長(zhǎng),為(12.1 ± 6.4)min, 其翻轉(zhuǎn)電位接近氯離子平衡電位。該電流具有較明顯的外向優(yōu)勢(shì),沒(méi)有明顯的時(shí)間依賴性失活和電壓依賴性失活。氯通道阻斷劑他莫昔芬(tamoxifen)可完全抑制該電流, 細(xì)胞外灌流高滲液也可完全抑制該電流。結(jié)論蟾蜍靈可以激活CNE - 2Z細(xì)胞氯通道產(chǎn)生氯電流,與容積激活性氯電流相比,該電流的潛伏期較長(zhǎng),并且有更明顯的外向優(yōu)勢(shì)。

蟾蜍靈; 鼻咽腫瘤; 氯通道

蟾蜍靈(bufalin)是中藥蟾酥的有效成分之一,主要從中華大蟾蜍的皮膚和耳后腺提取和分離。研究結(jié)果表明, 蟾蜍靈結(jié)構(gòu)與洋地黃極其相似,具有抑制細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶活性,使胞內(nèi)Ca2+濃度升高,具有升壓、強(qiáng)心等作用。近年研究發(fā)現(xiàn),蟾蜍靈能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期[1]及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。

我們前文報(bào)道,容積激活性氯通道在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡等生命活動(dòng)中起重要作用,氯通道阻斷劑能抑制細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期及阻抑抗腫瘤藥順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[3-5]。目前,關(guān)于蟾蜍靈對(duì)細(xì)胞膜離子通道作用方面的相關(guān)報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究的基礎(chǔ)上,用全細(xì)胞膜片鉗方法記錄蟾蜍靈對(duì)低分化鼻咽癌細(xì)胞(CNE - 2Z)的氯電流,并分析該電流的特征,為從離子通道的角度了解蟾蜍靈抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞培養(yǎng)

低分化鼻咽癌上皮細(xì)胞(CNE - 2Z)用含10 % 小牛血清、1×105U /L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPMI- 1640生長(zhǎng)液常規(guī)培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),置于37 ℃、飽和濕度、5 % CO2培養(yǎng)箱中。隔天傳代,操作在培養(yǎng)室超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

2灌流液

等滲灌流液(isotonic solution,Iso)滲透壓為300 mOsmol/L,含(mmol/L) : 70 NaCl,0.5 MgCl2,2 CaCl2, 10N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid (HEPES)和140 D- mannitol。47%高滲灌流液(hypertonic solution,Hyper)滲透壓為440 mOsmol/L,除溶液中D - mannitol為280 mmol/L 外, 其余成份和等滲液相同。灌流液用三羥甲基氨基甲烷(Tris base)緩沖液調(diào)pH值至7.4,用冰點(diǎn)滲透壓計(jì)(osmomat030,Gonotec) 檢測(cè)滲透壓。

3試劑

蟾蜍靈由暨南大學(xué)藥學(xué)院提供,用二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)配制成20 mmol/L 儲(chǔ)存液,在- 4 ℃ 保存。他莫昔芬購(gòu)自Sigma,實(shí)驗(yàn)前用甲醇將他莫昔芬配制成50 mmol/L 原液,在臨用前用灌流液將蟾蜍靈和他莫昔芬分別稀釋至1 μmol/L 和20 μmol/L。

4膜片鉗實(shí)驗(yàn)

4.1電極內(nèi)液 電極內(nèi)液含(mmol/L): 70 N -methyl - D - glucamine chloride (NMDG - Cl),1.2 MgCl2,10 HEPES,1 ethylene glycol bis(2-aminoethyl) tetraacetic acid (EGTA),140 D - mannitol 和2 adenosine - triphosphate (ATP)。用Tris base緩沖液調(diào)pH至7.25,用D - mannitol 調(diào)滲透壓至300 mOsmol/L,過(guò)濾除菌后分裝,于- 20 ℃ 保存, ATP在實(shí)驗(yàn)前加入。

4.2全細(xì)胞膜片鉗記錄 CNE-2Z細(xì)胞按常規(guī)用0.25 %胰酶消化后,將吹打成的單細(xì)胞混懸液接種在22 mm 小玻片上,置37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h 后,取出玻片置于特制圓形灌流槽中做全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。用EPC - 7膜片鉗放大器(List Electronic)記錄單個(gè)的CNE-2Z細(xì)胞全細(xì)胞電流。記錄電極使用硼硅酸鹽毛細(xì)玻璃管,在微電極拉制器( PB-7)上分2步拉制成微電極,充注電極內(nèi)液后的微電極尖端電阻約5-10 MΩ。電流和電壓信號(hào)用CED 1401(Cambridge)數(shù)字化(采樣頻率3 kHz) ,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用EPC (CED, Cambridge)軟件分析。根據(jù)細(xì)胞膜電容和全細(xì)胞電流大小,求出標(biāo)準(zhǔn)化后的全細(xì)胞電流密度(pA/pF)。鉗制電壓模式:細(xì)胞被鉗制在氯平衡電位,由EPC軟件包產(chǎn)生指令,以0 mV、±40 mV和±80 mV順序循環(huán)往復(fù),每一電位持續(xù)200 ms,兩電位之間間隔4 s。所有實(shí)驗(yàn)在室溫下(20 ℃- 24 ℃)進(jìn)行。

4.3蟾蜍靈激活氯電流 將細(xì)胞玻片安放在灌流槽中,全細(xì)胞記錄形成并測(cè)定細(xì)胞電容之后,先繼續(xù)用等滲灌流液灌流2-3 min,記錄穩(wěn)定的基礎(chǔ)電流,然后加入含1 μmol/L 蟾蜍靈的等滲灌流液以激活電流,并記錄激活電流的潛伏期(基礎(chǔ)電流強(qiáng)度值從開(kāi)始灌流蟾蜍靈到增大1倍所需的時(shí)間)。

4.4氯通道阻斷劑抑制氯電流 待蟾蜍靈激活細(xì)胞膜電流達(dá)到峰值并平穩(wěn)2 min 后,再加20 μmol/L他莫昔芬,待氯電流被抑制達(dá)到最小值并平穩(wěn)2 min 后,分析和計(jì)算氯通道阻斷劑他莫昔芬對(duì)蟾蜍靈激活的氯電流抑制效應(yīng)。

4.5蟾蜍靈激活氯電流的容積敏感性 當(dāng)蟾蜍靈激活細(xì)胞電流達(dá)到峰值并穩(wěn)定2 min 后,換為含1 μmol/L 蟾蜍靈的47 %高滲灌流液,觀察細(xì)胞容積縮小對(duì)蟾蜍靈激活氯電流的影響。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1蟾蜍靈緩慢激活CNE-2Z細(xì)胞電流

當(dāng)CNE-2Z細(xì)胞浸浴在等滲灌流液中時(shí),細(xì)胞膜基礎(chǔ)電流強(qiáng)度很小而且平穩(wěn)。細(xì)胞平均電流密度在+ 80 mV 電壓鉗制下為(5.11 ± 0.81) pA/pF,在- 80 mV電壓鉗制下為(-5.43 ± 0.83) pA/pF(n=8)。

在等滲灌流液中加入1 μmol/L 蟾蜍靈后,可緩慢激活細(xì)胞膜離子通道,產(chǎn)生一電流,見(jiàn)圖1,不同細(xì)胞電流激活的潛伏期長(zhǎng)短不一,差別較大,一般在5 min-15 min范圍內(nèi),潛伏期均值為(12.1 ± 6.4)min(n=8)。

Figure 1. The time course of bufalin-activated chloride currents in CNE-2Z cells.Membrane potentials were repeatedly clamped at 0,±40 and±80 mV.

2蟾蜍靈激活電流的特征

如圖2 所示,蟾蜍靈激活的電流表現(xiàn)為外向優(yōu)勢(shì),無(wú)明顯時(shí)間依賴性和電壓依賴性失活。當(dāng)電流緩慢增加至峰值并穩(wěn)定時(shí),其外向電流密度在+80 mV電壓鉗制下為(42.06 ± 5.88) pA/pF,內(nèi)向電流在-80 mV 電壓鉗制下為(22.77 ± 2.73) pA/pF,見(jiàn)圖3,外向電流比內(nèi)向電流大80 %左右,內(nèi)外向電流密度差異顯著(Plt;0.01)。

因?yàn)楣嗔饕汉碗姌O內(nèi)液中均不含有K+,而Na+和Ca2+在實(shí)驗(yàn)條件下的平衡電位超過(guò)+ 200 mV,而蟾蜍靈激活電流的翻轉(zhuǎn)電位為(- 7.98 ± 1.43)mV,見(jiàn)圖3,接近本實(shí)驗(yàn)條件Cl-平衡電位的理論值(- 0.9 mV),且在不同鉗制電壓下的電流方向與Cl-運(yùn)動(dòng)的方向一致,因此提示蟾蜍靈誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞的電流是氯電流。

Figure 2. The typical current traces induced by bufalin in CNE-2Z cells.Membrane potentials were repeatedly clamped at 0,±40 and±80 mV.

Figure 3. The current - voltage ( I - V) relationship of the bufalin - activated current in CNE-2Z cells. ±sE.n=8.**Plt;0.01 vs Iso. Iso: isotonic solution.

3他莫昔芬對(duì)蟾蜍靈激活氯電流的抑制作用

他莫昔芬是常用的氯離子通道阻斷劑,可完全抑制47 %低滲灌流液誘導(dǎo)的CNE-2Z 細(xì)胞產(chǎn)生容積激活性氯電流。本實(shí)驗(yàn)觀察了細(xì)胞外灌流20 μmol/L他莫昔芬對(duì)蟾蜍靈激活的氯電流作用,圖4A顯示了他莫昔芬作用于同一細(xì)胞前后的電流全過(guò)程。結(jié)果表明, 20 μmol/L 他莫昔芬可迅速而完全地抑制蟾蜍靈激活的氯電流(Plt;0.01),在他莫昔芬的作用下,蟾蜍靈激活的外向細(xì)胞電流密度峰值從(42.06 ± 5.88) pA/pF迅速減少至(2.58 ± 0.98) pA/pF(+80 mV),內(nèi)向電流密度峰值從(-22.77 ± 2.73) pA/pF快速下降至 (-2.52 ± 0.34) pA/pF(-80 mV),見(jiàn)圖4B。本結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)蟾蜍靈激活的電流是一個(gè)氯通道介導(dǎo)的氯電流。

4蟾蜍靈激活氯電流的容積敏感性

當(dāng)?shù)葷B灌流液加入1 μmol/L 蟾蜍靈后, 細(xì)胞膜氯通道開(kāi)放,氯電流增大,見(jiàn)圖5A。而當(dāng)膜電流增加至峰值并穩(wěn)定后, 再換為含蟾蜍靈的47 %高滲灌流液, 細(xì)胞發(fā)生皺縮,細(xì)胞容積縮小,可見(jiàn)電流顯著減小,見(jiàn)圖5B,表明蟾蜍靈誘導(dǎo)的Cl-電流對(duì)細(xì)胞容積變化敏感。

Figure 4. Inhibition of bufalin-activated Cl- currents by the chloride channel blocker tamoxifen in CNE - 2Z cells.A: the time course of inhibition of bufalin-activated chloride currents by tamoxifen; B:the mean currents recorded before (control) and after treatment with bufalin alone or with bufalin plus tamoxifen±sE.n= 8.**P lt; 0.01 vs bufalin.

Figure 5. Inhibition of bufalin-activated Cl- currents by the cell shrinkage induced by extracellular hypertonic shocks.A: current traces recorded in the isotonic solution containing bufalin; B: current traces recorded in 47 % hypertonic solution containing bufalin.

討 論

蟾蜍靈是從動(dòng)物蟾蜍的皮膚和耳后腺提取和分離、被認(rèn)為具有地高辛樣免疫活性的成分,也是目前臨床用于治療肝癌、胰腺癌等腫瘤的藥物華蟾素注射液的有效成分之一。蟾蜍靈能夠抑制細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶,使細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高,進(jìn)而促發(fā)Na+-Ca2+交換,增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。而Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)第二信使,其濃度升高后可通過(guò)進(jìn)一步激活蛋白激酶或離子通道等方式,產(chǎn)生以靶蛋白構(gòu)象變化為基礎(chǔ)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞功能改變。目前多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為蟾蜍靈抑制腫瘤細(xì)胞增殖主要與誘導(dǎo)細(xì)胞分化[6]、阻滯細(xì)胞周期及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[1,7]有關(guān),但其作用機(jī)制尚未完全清楚。

我們前期的研究表明,容積激活性氯通道是在細(xì)胞外低滲或細(xì)胞內(nèi)高滲而導(dǎo)致細(xì)胞腫脹時(shí)被激活,氯離子外流,伴隨水的外流,這是細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積回縮的主要機(jī)制之一[8]。在等滲狀態(tài)下,容積激活性氯離子通道和細(xì)胞容積改變參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)。例如在細(xì)胞周期進(jìn)程中,細(xì)胞容積是逐漸增大的,容積改變將影響胞內(nèi)包括參與DNA合成的各種酶等大分子有機(jī)物濃度,尤其是在G1/S期轉(zhuǎn)換點(diǎn)。而細(xì)胞可通過(guò)不同周期的調(diào)節(jié)性容積回縮能力改變來(lái)調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞容積平衡[3],參與細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)節(jié)。使用氯通道阻斷劑他莫昔芬、三磷酸腺苷和5-硝基-2-(3-苯丙胺基)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpro-pylamino) benzoic acid,NPPB]可以抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期,并抑制由順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[5]。蟾蜍靈能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但氯通道是否為蟾蜍靈作用的靶點(diǎn),目前尚未清楚。

本研究用全細(xì)胞膜片鉗的方法,直接觀察在等滲狀態(tài)下蟾蜍靈對(duì)CNE-2Z細(xì)胞氯離子通道的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)胞外灌流蟾蜍靈可以緩慢激活1個(gè)氯電流,該電流在不同鉗制電壓下其電流方向和Cl-運(yùn)動(dòng)方向一致,其翻轉(zhuǎn)電位接近Cl-的平衡電位,該電流可被氯通道阻斷劑他莫昔芬完全抑制,細(xì)胞外高滲導(dǎo)致細(xì)胞皺縮可使該通道關(guān)閉,Cl-外流顯著減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蟾蜍靈激活的是氯通道介導(dǎo)的氯電流,該電流的部分特征與我們前文報(bào)道的容積激活性氯電流相似[9],如具有外向優(yōu)勢(shì)及無(wú)明顯時(shí)間依賴性失活和電壓依賴性失活,對(duì)細(xì)胞容積縮小敏感等。但與細(xì)胞外低滲激活的容積激活性氯電流相比,蟾蜍靈激活氯電流的潛伏期更長(zhǎng),外向優(yōu)勢(shì)更明顯,外向電流比內(nèi)向電流增大約80%。CNE-2Z細(xì)胞容積激活性氯電流的潛伏期為1 min-2 min, 不同細(xì)胞的潛伏期差別較小[9],而蟾蜍靈激活氯電流的潛伏期長(zhǎng)達(dá)10多分鐘,且不同細(xì)胞的潛伏期差別較大。

雖然蟾蜍靈激活的氯電流和容積激活性氯電流部分特征相似,但兩者激活的條件不同,容積激活性氯電流是在低滲環(huán)境中被激活,而蟾蜍靈激活的氯電流卻是在等滲環(huán)境中產(chǎn)生,而且產(chǎn)生電流的潛伏期較長(zhǎng),這提示蟾蜍靈激活氯通道和低滲激活氯通道的類型和途徑可能不完全相同。Na+-K+-ATP酶對(duì)維持細(xì)胞滲透壓和細(xì)胞容積穩(wěn)定有重要作用[10],蟾蜍靈能抑制其活性,使胞內(nèi)Na+濃度升高,同時(shí),由于胞內(nèi)膜電位負(fù)值減少,胞外Cl-內(nèi)流,使胞內(nèi)Cl-濃度增加。胞內(nèi)Na+、Cl-濃度增加,可使胞漿滲透壓升高,這可能會(huì)引起細(xì)胞容積增大從而激活容積激活性氯通道。此外,蟾蜍靈也可能會(huì)在細(xì)胞容積不變的等滲狀態(tài)下,通過(guò)某些途徑直接激活氯通道。蟾蜍靈激活的氯離子通道的分子本質(zhì),有待進(jìn)一步的探討。

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Bufalinactivateschloridechannelsinpoorlydifferentiatednasopharyngealcarcinomacells

LUO Hai-bing1, LI Hua-rong2, LIU Shan-wen2, PENG Shuang2, LIU Zhen- feng2, YE Wen-cai3, ZHANG Dong-mei3, CHEN Li-xin2, WANG Li-wei2

(1DepartmentofPhysiology,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524023,China;2SchoolofMedicine,3CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:wangliweic@sohu.com;chenlixinw@sohu.com)

AIM: To investigate the activation of chloride channels induced by bufalin and the properties of the channels in poorly differentiated nasopharyngeal carcinoma (CNE-2Z) cells.METHODSThe technique of whole-cell patch clamp was used to record the chloride currents and to analyze the characteristics of the currents in CNE-2Z cells.RESULTSA chloride current was slowly activated by extracellular application of bufalin (1 μmol/L). The activation of the current was slower than that of the volume-activated chloride current, with an activation latency of(12.1±6.4) min. The reversal potential of the current was close to the calculated Cl-equilibrium potential (ECl= - 0.9 mV). The chloride current was outward-rectified and did not show significant time-dependent or voltage-dependent inactivation. The chloride channel blocker tamoxifen completely inhibited the outward and inward currents. The current was also completely inhibited by extra-cellular application of 47% hypertonic solution.CONCLUSIONBufalin activates chloride channels and induces a chloride current in CNE-2Z cells. Compared with the volume-activated chloride current in CNE-2Z cells, the activation latency of the bufalin-induced current is longer and the outward rectification is more obvious.

Bufalin; Nasopharyngeal neoplasms; Chloride channels

1000-4718(2011)04-0672-05

R739.63

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.010

2010-12-30

2011-02-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No.30771106; No.30870567; No. 30871267; No.90913020; No.U0932004);廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 07005974);廣東醫(yī)學(xué)院青年基金資助項(xiàng)目(No.XQ06013)。

△通訊作者 王立偉 Tel: 020-85220260;E-mail: wangliweic@sohu.com; 陳麗新 Tel: 020-85228865;E-mail: chenlixinw@sohu.com

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