阿力亞, 林 武, 何 強(qiáng)

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科, 廣東 廣州 510080)

FAK-shRNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選*

阿力亞, 林 武, 何 強(qiáng)△

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科, 廣東 廣州 510080)

目的研究利用RNA干擾技術(shù)，以黏附斑激酶(FAK)為靶基因，構(gòu)建FAK-shRNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將其導(dǎo)入包裝細(xì)胞Phoenix中，篩選出穩(wěn)定產(chǎn)生FAK-shRNA病毒的細(xì)胞克隆，以病毒上清感染并篩選FAK表達(dá)沉默的細(xì)胞株，觀(guān)察其對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法體外合成能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向FAK短發(fā)夾RNA(shRNA)的寡核苷酸并定向克隆入pSuper.retro逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Phoenix細(xì)胞株，待篩選穩(wěn)定克隆成功后收獲病毒上清，感染人肝癌細(xì)胞株HCC-LM3，以嘌呤霉素篩選得到抑制FAK表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株后用Western boltting鑒定FAK表達(dá)的抑制效果及相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSuper-FAK并抑制了人肝癌HCC-LM3細(xì)胞內(nèi)FAK蛋白的表達(dá)。在下調(diào)FAK表達(dá)的細(xì)胞株中p-Akt和p-MAPK1/2表達(dá)明顯受到抑制。下調(diào)FAK的細(xì)胞株遷移和侵襲能力下降，細(xì)胞周期多被阻止在G0/G1期，細(xì)胞凋亡增多，增殖率明顯下降。結(jié)論重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSuper-FAK轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞Phoenix后，其產(chǎn)生的FAK-shRNA病毒可以抑制HCC-LM3細(xì)胞內(nèi)的FAK蛋白表達(dá)并抑制Akt及MAPK1/2磷酸化。下調(diào)FAK后可以對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生明顯影響。

黏著斑激酶； RNA干擾； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體； 肝腫瘤

黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一種非受體酪氨酸激酶，它在細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附中起關(guān)鍵作用。研究證明，F(xiàn)AK在乳腺癌、宮頸癌、直腸癌、甲狀腺癌、前列腺癌、喉癌、舌癌和肺癌中表達(dá)量增高，高表達(dá)FAK通常與差的病理分型和預(yù)后相聯(lián)系，并且已經(jīng)在一些實(shí)體腫瘤如乳腺癌中探索了其活化機(jī)制以及其通過(guò)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞周期調(diào)控、黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移等的作用方式。但是對(duì)于肝癌中FAK介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性的相關(guān)研究甚少，目前尚不清楚FAK在肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、生存、凋亡過(guò)程中所處地位。本實(shí)驗(yàn)以肝癌細(xì)胞株為研究對(duì)象，構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并篩選出穩(wěn)定低表達(dá)FAK的細(xì)胞株，為后續(xù)研究打下研究基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSuper.retro由廣東省人民醫(yī)院病理生理研究部惠贈(zèng)，限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa；大腸桿菌菌株E.coliDH5α由廣東省人民醫(yī)院病理生理研究部惠贈(zèng)；脂質(zhì)體Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Tiangen；質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自Qiagen；上、下游引物由上海博尚生物有限公司合成。FAK兔抗人抗體購(gòu)自Santa Cruz，Akt、p-Akt、MAPK1/2、p-MAPK1/2抗體購(gòu)自Cell Signal；Transwell小室和培養(yǎng)瓶購(gòu)自Corning；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12和胎牛血清購(gòu)自Gibco；嘌呤霉素購(gòu)自Sigma；matrigel 購(gòu)自BD。

1.2細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞株HCC-LM3由廣東省人民醫(yī)院病理生理研究部惠贈(zèng)；包裝病毒細(xì)胞株P(guān)hoenix 購(gòu)自O(shè)rbigen。

2方法

2.1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的FAK基因序列(GI:439874)，按shRNA的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)目的shRNA序列， BLAST對(duì)比分析。構(gòu)建質(zhì)粒3’端酶切位點(diǎn)之前加入Pol III聚合酶終止信號(hào)TTTT，以L(fǎng)oop(9 nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu))相連，兩端分別加入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ,正義鏈5’-GATCCGCCACCTGGGCCAGTATTATTTCAAGACGATAATACTGGCCCAGGTGGTTTTTTGTCGACA-3’,反義鏈3’-GCGGTGGACCCGGTCATAATAAAGTTCTGCTATTATGACCGGGT-CCACCAAAAAACAGCTGTTCGA-5’。

2.2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 將合成的正、反義鏈經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性后形成雙鏈FAK-shRNA，定向克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSuper.retro后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株E.coliDH5α，以氨芐青霉素(100 mg/L)篩選出陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。

2.3重組質(zhì)粒FAK-shRNA 的鑒定 重組質(zhì)粒用BamHⅠ與HindⅢ酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行0.8%瓊脂糖凝膠電泳。選取陽(yáng)性克隆純化后送到上海博尚生物公司測(cè)序鑒定，命名為FAK-pSuper-shRNA。

2.4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝病毒細(xì)胞株 將包裝病毒細(xì)胞Phoenix接種到6孔板中，1×105cells/well，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后更換無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)1 h，分別使用空載體pSuper.retro、pSuper-FAK質(zhì)粒各5 μg，脂質(zhì)體Lipofectamine2000 6 μL /well轉(zhuǎn)染Phoenix。轉(zhuǎn)染6 h后更換完全培養(yǎng)基，48 h后加入1 mg/L嘌呤霉素，篩選3-4周獲得陽(yáng)性克隆。細(xì)胞株命名為293T-Phoenix-pSuper-FAK及293T-Phoenix-pSuper-control。

2.5重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HCC-LM3細(xì)胞株 將篩選獲得的Phoenix陽(yáng)性克隆培養(yǎng)至90%融合后換成無(wú)嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞上清。HCC-LM3細(xì)胞株接種到6孔板中，每孔加入1 mL Phoenix細(xì)胞上清濾液， 37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換含1 mg/L嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選，每3-4 d換液，約40 d后篩選完成。所產(chǎn)生的細(xì)胞株分別命名為L(zhǎng)M3-pSuper-FAK及LM3-pSuper-control。

2.6Western blotting檢測(cè)FAK蛋白的沉默及Akt、p-Akt、MAPK1/2、p-MAPK1/2表達(dá)情況 將篩選后的HCC-LM3細(xì)胞株接種到6孔板中，培養(yǎng)至每孔1×105細(xì)胞時(shí)，收集細(xì)胞。用細(xì)胞裂解液裂解，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，上樣量25 μg總蛋白， 10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，用含5%脫脂奶粉的T-TBS 37 ℃封閉1 h，分別加入兔抗人FAK、Akt、p-Akt、MAPK1/2和p-MAPK1/2 單克隆抗體(1∶1 000 稀釋?zhuān)?Santa Cruz)或兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶8 000稀釋?zhuān)琒anta Cruz) 4 ℃孵育過(guò)夜。T-TBS漂洗5 min×3次;兔抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗(1∶7 000稀釋?zhuān)琒anta Cruz)4 ℃孵育45 min； T-TBS漂洗5 min×3次；SuperSignal West Femto(Pierce)敏感曝光試劑盒曝光底片顯影。

2.7細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 在Transwell下室的DMEM培養(yǎng)液中加入10%血清，在Transwell上室分別滴加1×105LM3-pSuper-FAK及LM3-pSuper-control細(xì)胞懸液(無(wú)血清)。將上室置于下室之中， 在37 ℃溫箱孵育24 h后取出上室，以棉簽將殘留在上室內(nèi)表面上的細(xì)胞輕輕拭去。上室用PBS洗滌后，遷移至上室膜外上的細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色，以清水洗3遍，顯微鏡下(×100)計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù), 結(jié)果取5個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值。

2.8細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 操作按Corning公司Transwell書(shū)明書(shū)進(jìn)行，鋪matrigel按照BD公司說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在Transwell上室分別滴加5×104LM3-pSuper-FAK及LM3-pSuper-control細(xì)胞懸液(無(wú)血清)。在37 ℃溫箱孵育36 h后取出上室，以棉簽將殘留在上室內(nèi)表面上的細(xì)胞輕輕拭去。上室用PBS洗滌后，遷移至上室膜外上的細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色，以清水洗3遍，顯微鏡下(×100)計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù), 結(jié)果取5個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值。

2.9流式細(xì)胞儀檢測(cè) LM3-pSuper-FAK及LM3-pSuper-control細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡 將LM3-pSuper-FAK及LM3-pSuper-control細(xì)胞分別制成單個(gè)細(xì)胞懸液，70%預(yù)冷乙醇固定， PBS洗滌，再用碘化丙啶(propidium iodide,PI)處理備檢。用ProfileⅡ型流式細(xì)胞儀，在488 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定細(xì)胞DNA，分析細(xì)胞周期及檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡情況。

3.0MTT檢測(cè) LM3-pSuper-FAK及LM3-pSuper-control細(xì)胞的細(xì)胞增殖率將LM3-pSuper-FAK、LM3-pSuper-control及未處理的LM3細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，細(xì)胞計(jì)數(shù)后每孔加入200 uL鋪96孔板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1 000 cells/well，設(shè)置凋零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)及空白對(duì)照孔(培養(yǎng)液、二甲基亞砜)，邊緣孔用PBS填充。37 ℃培養(yǎng)箱孵育48 h后，每孔加入20 uL MTT溶液4 h，每孔加入150 uL二甲基亞砜，避光置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀A570處測(cè)量各孔的吸光度值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒

將提取的重組質(zhì)粒送交上海博尚生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的片段成功連接于載體中，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The DNA sequence of a recombinant.

2Westernblotting檢測(cè)FAK蛋白的沉默

經(jīng)Western blotting檢測(cè)分析表明，內(nèi)參為均一顯影的條帶，F(xiàn)AK顯影條帶密度不同,見(jiàn)圖2。未處理組及對(duì)照組FAK蛋白表達(dá)量與LM3-pSuper-FAK組比差異顯著， LM3-pSuper-FAK 組蛋白表達(dá)量明顯減少。

3沉默F(xiàn)AK對(duì)LM3中Akt、p-Akt、MAPK1/2、p-MAPK1/2表達(dá)的影響

經(jīng)Western blotting檢測(cè)分析表明，下調(diào)FAK后可見(jiàn)p-Akt和p-MAPK1/2蛋白表達(dá)明顯減少，Akt及MAPK1/2未見(jiàn)明顯改變，見(jiàn)圖3。

Figure 2. Western blotting analysis of FAK in HCC-LM3 cells±s.n=3.*Plt;0.05 vs LM3-pSuper-control group.

4下調(diào)FAK表達(dá)對(duì)LM3細(xì)胞遷移侵襲的影響

經(jīng)過(guò)Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析表明，下調(diào)FAK后可見(jiàn)LM3-pSuper-FAK組遷移率及侵襲能力明顯下降。遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目對(duì)照組為(52.12±11.38) cells/視野，實(shí)驗(yàn)組為(22.67±4.36) cells/視野,見(jiàn)圖4。穿過(guò)metrigel的細(xì)胞數(shù)對(duì)照組為(23.53±4.54)cells/視野，實(shí)驗(yàn)組為(5.34±0.73)cells/視野，兩組比較差異顯著(Plt;0.05)，見(jiàn)圖5。

5下調(diào)FAK表達(dá)對(duì)LM3細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡影響

經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析表明，LM3-pSuper-FAK組凋亡細(xì)胞數(shù)占總檢測(cè)細(xì)胞數(shù)的(6.00±1.23)%，LM3-pSuper-control組為(0.88±0.12)%，兩者比較差異顯著(Plt;0.01)。LM3-pSuper-FAK G0/G1期比率是(64.0±2.4)%，相對(duì)LM3-pSurper-control組(44.8±1.6)%，有更多的細(xì)胞阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見(jiàn)圖6。

6下調(diào)FAK對(duì)LM3細(xì)胞增殖率的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖7)，下調(diào)FAK表達(dá)的人肝癌細(xì)胞LM3-pSuper-FAK、LM3-pSuper-control細(xì)胞的增殖抑制率分別為(27.97±0.34)%和(5.45±0.22)%，兩組相比差異顯著(Plt;0.01)。

Figure 3. Western blotting analysia the expression of Akt,p-Akt,MAPK and p-MAPK protein in HCC-LM3 cells. ±s. n=3. **Plt;0.01 vs LM3-pSuper-control group.

Figure 4. LM3-pSuper-FAK and LM3-pSuper-control cells were added into the upper chamber of the Transwell chamber without matrigel.After 24 h 37 ℃ incubation, the cells in the lower chamber were counted(crystal violet staining,×100).±s. n=5. *Plt;0.05 vs LM3-pSuper-control group.

Figure 5. LM3-pSuper-FAK and LM3-pSuper-control cells were added into the upper chamber of the Transwell chambe with matrigel.After 36 h 37℃ incubation, the cells in the lower chamber were counted(crystal violet staning,×100).±s. n=5. *Plt;0.05 vs LM3-pSuper-control group.

Figure 6. Cell cycle and apoptosis tested by flow cytometry±s. n=3.*Plt;0.05, ** Plt;0.01 vs LM3-pSuper-control group.

Figure 7. The proliferation of LM-3 cells after knowndown of FAK. .n=3.**Plt;0.01 vs LM3-pSuper-control group.

討 論

黏著斑激酶(FAK)在腫瘤的遷移、增殖、生存、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管形成及白血病等起著重要的調(diào)控作用[1-6]。本課題探討了應(yīng)用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)對(duì)FAK基因進(jìn)行沉默并篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，并觀(guān)察其對(duì)肝癌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

RNAi是指在生物體細(xì)胞內(nèi)，外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA 引起與其同源mRNA的特異性降解，抑制其相應(yīng)基因的表達(dá)，其作為一種新興的逆向遺傳研究方法，與傳統(tǒng)的基因療法相比具有高效、高特異性及無(wú)毒副作用等特點(diǎn)[7]。構(gòu)建shRNA表達(dá)載體基于具有合適啟動(dòng)子的載體或轉(zhuǎn)錄元件，在細(xì)胞體內(nèi)經(jīng)過(guò)酶切持續(xù)生成大量的siRNA，其抑制目的基因的效果與合成siRNA的相似，但更加穩(wěn)定。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能將外源基因有效地整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞分裂而傳給后代，獲得包裝細(xì)胞株后可以穩(wěn)定的得到含有目的載體的病毒顆粒，而且未經(jīng)包裝時(shí)為缺陷性病毒，不具有完整功能，只有經(jīng)包裝細(xì)胞系為其提供結(jié)構(gòu)蛋白組分，二者相互補(bǔ)償后才能包裝成具有完整功能的病毒顆粒，因此感染靶細(xì)胞后不能擴(kuò)增，具有很高的安全性[8]。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了針對(duì)FAK基因的shRNA表達(dá)載體FAK-pSuper-shRNA，并成功篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，得到不同抑制率的FAK陽(yáng)性克隆，以Western blotting觀(guān)察FAK蛋白表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示FAK-pSuper-shRNA重組質(zhì)粒的干擾組能明顯降低FAK蛋白的表達(dá)。相對(duì)使用化合物或反義寡核苷酸等方法，利用病毒介導(dǎo)的RNAi更具效率，且可以得到持續(xù)傳代的穩(wěn)定表達(dá)，有利于保持實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。在進(jìn)行細(xì)胞株篩選的過(guò)程中我們也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于人肝癌細(xì)胞株LM3，下調(diào)FAK后其生長(zhǎng)緩慢，我們猜測(cè)相對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，在篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株時(shí)除去FAK本身對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響外，還有細(xì)胞內(nèi)環(huán)境在適應(yīng)FAK低表達(dá)的過(guò)程中需要調(diào)動(dòng)其他信號(hào)通路來(lái)補(bǔ)償FAK的功能的原因，那么可能在這種穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株繼續(xù)檢測(cè)敲除FAK對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路影響時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或利用特異性抑制劑所產(chǎn)生的結(jié)果存在區(qū)別，有研究以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)行RNA干擾，同樣可以較高效率抑制FAK蛋白表達(dá)[9]，但是穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株因其具有實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性，可以為今后的研究打下基礎(chǔ)。

Akt又稱(chēng)蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞存活途徑中起重要作用。Akt的活化形式是磷酸化，其有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)，只有當(dāng)2個(gè)位點(diǎn)完全磷酸化后才能使Akt完全活化。Akt作為PI3K/Akt 信號(hào)通路中與人類(lèi)惡性腫瘤相關(guān)的下游主要效應(yīng)靶基因，它可以活化許多不同類(lèi)型的效應(yīng)底物，對(duì)細(xì)胞生存、細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞生長(zhǎng)等有很大的影響，活化的Akt在抑制細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲方面起重要作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中均有Akt及其磷酸化過(guò)度表達(dá)及活化[10]。并且在活化過(guò)程中可以誘導(dǎo)caspase-3抑制蛋白survivin的表達(dá)，其還可以在無(wú)ERK信號(hào)通路參與的情況下促進(jìn)線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C，激活內(nèi)源性的信號(hào)通路[11]。有研究表明當(dāng)Akt過(guò)度激活后，可以促進(jìn)抗凋亡基因bcl-2表達(dá)，抑制促凋亡基因bax表達(dá)，從而使細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性降低[12]

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPK1/2是發(fā)現(xiàn)最早、研究最廣的MAPK家族成員。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，它參與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖與分化、衰老和凋亡、基因轉(zhuǎn)錄等多種細(xì)胞生命事件的調(diào)控，磷酸化為其活化形式。MAPK1/2 在一系列反應(yīng)如生長(zhǎng)因子和有絲分裂等刺激中被激活，同時(shí)其持續(xù)活化最終促進(jìn)細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化。p-ERK1/2 的下調(diào)則可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和生長(zhǎng)刺激基因轉(zhuǎn)錄的抑制。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) MAPK在一些惡性腫瘤中被明顯激活[13]。

本研究結(jié)果表明，當(dāng)下調(diào)FAK表達(dá)之后，Akt及MAPK表達(dá)無(wú)明顯改變，但其磷酸化明顯被抑制，說(shuō)明在肝癌細(xì)胞LM3中，F(xiàn)AK可以影響Akt及MAPK的活化程度，通過(guò)下調(diào)FAK表達(dá)，可以對(duì)惡性腫瘤中異常激活的信號(hào)通路產(chǎn)生影響，并起到抑制腫瘤的作用。同時(shí)通過(guò)細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)FAK之后腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力下降。流式細(xì)胞儀檢測(cè)下調(diào)FAK后的LM3細(xì)胞主要停留在G0/G1期并且細(xì)胞凋亡增多。MTT實(shí)驗(yàn)也證明下調(diào)FAK表達(dá)可使細(xì)胞增殖率下降。

以FAK基因?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)，構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)FAK基因的人肝癌細(xì)胞株LM3，并探討了RNAi對(duì)于該基因表達(dá)的抑制作用及沉默該基因表達(dá)后對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)和腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為下一步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)并為肝癌的基因治療提供理論依據(jù)。

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ConstructionofFAK-shRNAretroviralvectorandscreeningofstableHCC-LM3celllinewithpersistentknockdownofFAK

Aliya, LIN Wu, HE Qiang

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail: 1heqiang@hotmail.com)

AIM: To construct a recombinant retroviral vector of short interfering RNA targeting focal adhesion kinase (FAK) gene and to establish a cell line with stable knockdown of FAK.METHODSThe oligonucleotides that transcribed to short hairpin RNA (shRNA) targeting FAK gene were synthesizedinvitro, cloned into retroviral vector pSuper.retro and transfected into Phoenix cell line. The stable clones were screened and high-titer virus was produced. The human hepatocellular carcinoma cell line HCC-LM3 was infected with the virus-rich supernatant. The stable LM3 cell line, which showed significantly to silence FAK and associated proteins, was selected by puromycin.RESULTSThe recombinant retroviral vector was successfully constructed. Persistent knockdown of FAK in the LM3 cell line infected with the supernatant containing the retrovirus was confirmed by Western blotting. Down-regulation of FAK resulted in the inhibition of p-Akt and p-MAPK1/2 expression and led to decreased migration and invasion of the cells. The cell cycle was blocked at G0/G1phase, and apoptosis was increased. The proliferation rate also decreased significantly.CONCLUSIONFAK-shRNA virus generated by recombinant retroviral vector pSuper-FAK can inhibit the protein expression of FAK and phosphorylation of Akt and MAPK1/2 in HCC-LM3 cells. Down-regulation of FAK shows a significant impact on biological behaviors of tumor cells.

Focal adhesion kinase; RNA interference; Retroviral vector; Liver neoplasms

1000-4718(2011)04-0688-07

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.013

2010-11-01

2011-02-25

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.07001638)

△通訊作者 Tel:020-87755766-8214；E-mail：1heqiang@hotmail.com