巫少榮, 李自成△, 余 健, 郭 軍, 張愛東, 林如波

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣東 廣州 510632；2澳門仁伯爵綜合醫(yī)院心內(nèi)科,中國 澳門)

大蒜素對心室肌細(xì)胞膜鈉通道電流的影響*

巫少榮1, 李自成1△, 余 健1, 郭 軍1, 張愛東1, 林如波2

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣東 廣州 510632；2澳門仁伯爵綜合醫(yī)院心內(nèi)科,中國 澳門)

目的研究大蒜素對心室肌細(xì)胞膜鈉通道電流(INa)的影響,探討大蒜素在離子通道水平的藥理作用機(jī)制。方法用急性酶解法分離大鼠心室肌細(xì)胞,應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù),觀察不同濃度的大蒜素對鈉通道的影響。結(jié)果(1)快鈉通道電流:大蒜素對豚鼠心室肌細(xì)胞INa呈電壓依賴性和濃度依賴的抑制作用。(2)大蒜素對INa電流密度-電壓關(guān)系(I-V)曲線的影響:給藥前INa電流密度在膜電位-40 mV達(dá)到最大峰值為(-13.41±6.95)pA/pF;在500 μmol/L灌流法給藥后,電流密度最大峰值為(-8.53±3.70)pA/pF,給藥后電流密度減少約48%。給藥前后電流密度變化有顯著差異(Plt;0.01)。(3)大蒜素對INa激活-失活曲線的影響:在大蒜素500 μmol/L灌流法給藥后,激活曲線顯示給藥前后半數(shù)激活電壓為(-44.72±15.61) mVvs(-45.66±17.86)mV，斜率因子為-2.7±0.8vs-2.2±0.7，給藥前后變化無顯著差異。失活曲線顯示大蒜素使失活曲線向負(fù)電位方向變化，差異顯著;半數(shù)失活電壓為(-88.61±9.60) mVvs(-103.03±8.90) mV(Plt;0.01)，斜率因子為-7.85±0.88vs-7.55±2.75(Pgt;0.05)。結(jié)論大蒜素可濃度依賴性和電壓依賴性地抑制心肌細(xì)胞膜鈉通道電流;給藥后I-V曲線上移，顯著減少電流密度；其對失活曲線有明顯影響，提示大蒜素主要作用于鈉通道的失活態(tài)。

大蒜素; 膜片鉗術(shù); 鈉通道; 心室肌細(xì)胞

大蒜素(garlicin)是大蒜的有效單體成分，早已發(fā)現(xiàn)它具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤和殺蟲等作用。近年來發(fā)現(xiàn)其還有抗心律失常、抗動脈粥樣硬化和降血壓等心血管方面作用。其抗心律失常作用的細(xì)胞電生理學(xué)機(jī)制一直未明。本研究應(yīng)用膜片鉗技術(shù)觀察大蒜素對心肌細(xì)胞膜上鈉離子通道的作用，以期從心肌細(xì)胞離子通道水平明確大蒜素抗心律失常的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1藥物

大蒜素注射液由上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)。

2試劑

膠原酶Ⅰ(collagenase I)、氯化膽堿(choline-Cl)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)均為Sigma產(chǎn)品。無鈣液(mmol/L)：NaCl 136、KCl 54、MgCl2·6H2O 1、NaH2PO4·2H2O 0.33、HEPES 10、glucose 10，pH 7.4 with KOH。電極內(nèi)液(mmol/L)：CsCl 100、CsF 110、HEPES 5、NaCl 5、 EGTA 10、MgCl21、Na2-ATP 5，pH 7.2 。細(xì)胞外液(mmol/L)：MgCl2.6H2O 1、CaCl20.5、HEPES 10、glucose 10、CsCl 5.4、choline-C l 130、NaCl 5、NaH2PO40.33、CoCl20.5，pH 7.4。

3方法

大鼠處死后,迅速開胸,取出心臟,在4 ℃無鈣臺氏液中去除脂肪及心包膜后,固定在Langendorff灌流裝置上,用無鈣液經(jīng)主動脈逆行灌流,整個灌流過程溫度37 ℃,通以95% O2+ 5% CO2混合氣,灌流壓約70 cmH2O。10 min后轉(zhuǎn)換成用含膠原酶I(0.5 g/L)和牛血清白蛋白(1 g/L)的無鈣液灌流,20 min后將心室肌剪下,放入高鉀液中吹打得到單個心室肌細(xì)胞，保存?zhèn)溆谩?/p>

3.1膜片鉗全細(xì)胞記錄方法 選取紋理清晰、桿狀和大小適中的細(xì)胞在室溫下進(jìn)行實驗，將適量細(xì)胞加入體積約1.5 mL平放于倒置顯微鏡(Olympus IX 70型)上的細(xì)胞池中，貼壁8 min后，用灌流法加藥，流速約1.5 mL/min。在電極拉制儀(Narishige PP830型)分2步拉制電極，電阻2-4 MΩ。電極內(nèi)灌以電極液，置于推進(jìn)器上，通過三維操縱器(Narishige)驅(qū)動電極，并輕壓在細(xì)胞表面，用負(fù)壓使電極與細(xì)胞表面形成高阻封接后，用ZAP吸破細(xì)胞膜，補(bǔ)償電容電流及電極串聯(lián)電阻，形成全細(xì)胞模型。信號經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，由膜片鉗AXON 200B放大器放大。實驗過程由pCLAMP 7.0 軟件程序(Axon)控制，通過AD/DA轉(zhuǎn)換板(AXON DigiData1200)進(jìn)行刺激發(fā)放和信號采集，并存儲于計算機(jī)硬盤中。

4統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1大蒜素對鈉通道電流(INa)的影響

電極內(nèi)液用Cs+代替K+阻斷鉀電流，電極外液用CoCl2阻斷鈣電流。細(xì)胞鉗制電位(holding potential，HP)在-120 mV，施以鉗制時間(clamp time，CT)100 ms的指令電位(command potential，CP)從-80 mV到+5 mV的序列除極方波，刺激頻率0.5 Hz，步長5 mV，誘發(fā)出具有電壓依賴性內(nèi)向鈉電流。500 μmol/L大蒜素作用10 min后可見內(nèi)向鈉電流減少，用灌流液沖洗后可恢復(fù)部分抑制的鈉電流，這可進(jìn)一步說明內(nèi)向鈉電流減少是大蒜素作用引起的。用鈉通道阻斷劑3 μmol/L利多卡因可以阻斷該電流，可進(jìn)一步證實所測電流為鈉通道電流，見圖1。

Figure 1. Effect of garlicin on sodium channel current.A:control; B:garlicin 500 μmol/L; C:post-washing; D:lidocaine 3 μmol/L; E:stimulation square wave.

2大蒜素對鈉通道電流作用的量效曲線

用累積加藥法，分別觀察100、300、750 μmol/L大蒜素對大鼠心室肌細(xì)胞INa的影響。結(jié)果如圖2所示，隨著大蒜素濃度增加對INa抑制作用增強(qiáng)。

3大蒜素對INa電流密度-電壓關(guān)系曲線的影響

以CP為橫坐標(biāo)，其相應(yīng)INa峰值為縱坐標(biāo)，繪制電流密度-電壓曲線(I-V)，見圖3。給藥前INa電流密度在膜電位(membrane potential,MP)-40 mV達(dá)到最大峰值，為(-13.41±6.95)pA/pF；在500μmol/L大蒜素灌流法給藥后，電流密度最大峰值為(-8.53±3.70)pA/pF，給藥后電流密度減少約48%。給藥前后電流密度變化差異顯著(Plt;0.01)。

Figure 2. Dose-effect curve of garlicin for sodium channel current.

Figure 3. Current density-voltage curve of garlicin for INa current density ±s.n=6.Current density (pA/pF)= current intensity/capacitance;MP:membrane potential.

4大蒜素對鈉通道激活-失活曲線的影響

以各次條件刺激時測試所得的INa峰值(I)，計算相對電流I/Imax，以CP為橫坐標(biāo)，其相應(yīng)的I/Imax為縱坐標(biāo)，繪制激活曲線，見圖4。采用雙脈沖刺激法，HP為-120 mV，予0.5 Hz、100 ms、-80 mV～ +25 mV的去極化脈沖，在每次條件脈沖后都緊跟以1個固定的80 ms，去極化至-40 mV的測試脈沖，以相對電流I/Imax為縱坐標(biāo)，CP為橫坐標(biāo)，繪制失活曲線，見圖5。失活曲線用Boltzmann方程=1/{1+exp[(Vm-V1/2)/S]}，(Vm：膜電位；V1/2：半數(shù)最大失活電位；S：斜率因子)擬合。

在500 μmol/L大蒜素灌流法給藥后，激活曲線顯示給藥前后半數(shù)激活電壓為(-44.72±18.61)mVvs(-45.66±17.86)mV,Pgt;0.05;斜率因子為-2.7±0.8vs-2.2±0.7，Pgt;0.05，給藥前后變化無顯著差異。失活曲線顯示：大蒜素使失活曲線向負(fù)電位方向變化，差異顯著；半數(shù)失活電壓為(-88.61±9.60)mV vs (-103.03±8.90)mV，Plt;0.01);斜率因子為-7.85±0.88vs-7.55±2.75(Pgt;0.05)。

Figure 4. Active curve of garlicin for sodium channel .±s.n=6. MP：membrane potential.

Figure 5. Inactive curve of garlicin for sodium channel±s.n=5. MP：membrane potential.

討 論

大蒜屬于百合科蔥屬二年生草本植物，以鱗莖、花莖、嫩葉為主要產(chǎn)品。大蒜中的有效單體成分為大蒜素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為CH2=CH-CH2-S-S-S-CH2-CH=CH2。早已發(fā)現(xiàn)它具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤和殺蟲等作用[1,2]，近年來發(fā)現(xiàn)其還有抗心律失常、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、抗動脈粥樣硬化和降血壓等心血管方面作用[3-5]。已有臨床實驗發(fā)現(xiàn)：使用大蒜素注射液可以有效地治療心律失常，特別是各種期前搏動[6]。動物實驗表明大蒜素有抑制心肌收縮、減慢心率等作用。通過離體動物實驗?zāi)Ｐ?，有學(xué)者研究大蒜素對豚鼠心房肌電生理的作用，發(fā)現(xiàn)大蒜素能降低心肌自律性和興奮性，延長有效不應(yīng)期[7,8]。國內(nèi)一些學(xué)者[7]還研究大蒜素對豚鼠在體心電圖、離體右房自律性及收縮性的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度(5.25 mg/kg)的大蒜素，最先使心肌Q-T間期延長；中濃度(26.25 mg/kg)的大蒜素，進(jìn)一步抑制竇性心率及減慢房室傳導(dǎo)。由于缺乏對心肌細(xì)胞電生理及膜離子通道研究，大蒜素抗心律失常的確切機(jī)制目前尚不清楚。在心肌細(xì)胞離子通道水平探討其藥理機(jī)制，尤其是其對心肌細(xì)胞鈉離子通道電流及動作電位的影響，目前還未見有研究報道。

鈉通道活性與動作電位的形成(0期)有關(guān)，是心肌細(xì)胞去極化主要的跨膜離子流，影響心肌細(xì)胞的興奮和傳導(dǎo)。鈉通道阻斷劑在心血管系統(tǒng)是作為一類重要的抗心律失常藥使用。關(guān)于Ⅰ類抗心律失常藥物的作用機(jī)制，目前普遍易于接受的學(xué)說是1977年由Hondgen等[9]提出的受體調(diào)節(jié)假說(medulated receptor theory)，認(rèn)為：(1)抗心律失常藥物與受體結(jié)合后發(fā)生作用，該受體位于或非常接近細(xì)胞膜離子通道；(2)藥物與受體結(jié)合、解離與離子通道狀況及膜電位有關(guān)。離子通道狀況包括靜息態(tài)、激活態(tài)、失活態(tài)3種狀態(tài)。鈉通道的活性異常影響心肌的傳導(dǎo)性和興奮性，從而產(chǎn)生折返、異常自律性或觸發(fā)活動，形成各種快速心律失常。所以鈉通道已成為許多抗心律失常藥物作用的靶點(diǎn)[10,11]。離子通道被藥物阻滯后，抑制了心肌細(xì)胞的興奮性和傳導(dǎo)性，從而發(fā)揮抗心律失常作用。

本實驗應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，觀察不同濃度的大蒜素對大鼠心室肌細(xì)胞鈉通道電流的影響。研究結(jié)果表明給藥后INaI-V曲線上移，顯著減少電流密度；量效曲線顯示大蒜素對INa的抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，提示大蒜素對鈉通道呈濃度依賴性和電壓依賴性的阻滯作用; 同時表明大蒜素對INa具有中度的阻滯作用；給藥后鈉通道激活曲線左移但給藥前后變化無顯著差異，表明大蒜素對鈉通道激活態(tài)雖有作用但影響不大。給藥后對鈉通道失活曲線有明顯影響，給藥前后變化有顯著差異，表明大蒜素對鈉通道的激活態(tài)及失活態(tài)均有影響,但主要作用于鈉通道的失活態(tài)，由此提示該藥物對處于除極狀態(tài)的病損細(xì)胞鈉通道親合力較高，因而該藥物對快速型心律失常的療效可能更為明顯。大蒜素對鈉通道的阻滯作用是其抗心律失常作用機(jī)制的重要組成部分。大蒜素對心肌細(xì)胞其它離子通道的影響還需要進(jìn)一步研究。

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Effectofgarlicinonsodiumchannelcurrentinratventricularmyocytes

WU Shao-rong1, LI Zi-cheng1, YU Jian1, GUO Jun1, ZHANG Ai-dong1,LIN Ru-bo2

(1DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofCardiology,HospitalCondeS.Janurio,Macau,China.E-mail:zichengli@163.net)

AIM: To observe the effect of garlicin on sodium channel(INa) in isolated ventricular myocytes of rats.METHODSThe ventricular myocytes of rats were obtained by enzymatic dissociation and treated with different concentrations of garlicin. The change ofINawas recorded by the technique of whole-cell patch clamp recording.RESULTSGarlicin decreased theINaof isolated ventricular myocytes in a dose- and voltage-dependent manner. The current density was elevated to peak [(-13.41±6.95) pA/pF]under the condition that the membrane voltage was -40 mV before treated with garlicin. The current density was decreased by 48% from peak after treated with 500 μmol/L garlicin [(-8.53±3.70) pA/pF,Plt;0.01]. No significant change of the active curve with the use of garlicin was observed. The median inactive voltages of the inactive curves before and after garlicin treatment were (-88.61±9.60) mV and (-103.03±8.90) mV (Plt;0.01), respectively, and the slopes were -7.85±0.88 and -7.55±2.75 (Pgt;0.05), respectively, indicating that garlicin made a shift to the negative direction.CONCLUSIONGarlicin treatment induced the current density-voltage curve ofINato shift up and significantly decreased the current density. The inactive curve of sodium channel moved to the left, while the current density was not decreased after treated with garlicin. Garlicin blocks sodium channel in its inactive state in a dose- and voltage-dependent manner.

Garlicin; Patch clamp techniques; Sodium channels; Ventricular myocytes

1000-4718(2011)04-0658-04

R285.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.007

2010-11-22

2011-02-10

廣東省中醫(yī)藥局科研基金資助項目(No.2009171);暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科基金資助項目(暨一臨【2010】4號)

△通訊作者 Tel: 020-38688620; E-mail：zichengli@163.net