朱曉峰， 張榮華， 孫升云， 王攀攀， 楊 麗， 韓 莉， 金 玲

(暨南大學 1附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，2藥學院中藥學教研室，廣東 廣州 510630)

淫羊藿素通過雌激素受體和骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號誘導MC3T3-E1 subclone 14細胞分化*

朱曉峰1， 張榮華2△， 孫升云1， 王攀攀2， 楊 麗2， 韓 莉1， 金 玲1

(暨南大學1附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，2藥學院中藥學教研室，廣東 廣州 510630)

目的： 觀察淫羊藿素(ICT)對MC3T3-E1 subclone 14前體成骨細胞株增殖、分化的影響，以及雌激素受體(ER)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號在分化中的作用。方法WST-8、BrdU法檢測ICT對MC3T3-E1 subclone 14細胞活力和增殖的影響；ICI182780阻斷ER受體信號后，檢測ICT和noggin對MC3T3-E1 subclone 14細胞堿性磷酸酶(ALP)活性、I型膠原(Col I)和骨鈣素(BGP)的影響；實時熒光PCR檢測ICT對BMP-2、4、7 mRNA表達的影響；Western blotting檢測ER受體信號阻斷后，ICT對Smad1/5/8蛋白磷酸化的影響。結果ICT(0.1 μmol/L、1 μmol/L)可以提高MC3T3-E1 subclone 14細胞ALP、Col I、BGP和礦化結節(jié)數(shù)量(Plt;0.01或Plt;0.05)，表明ICT有促分化的作用，但對細胞活力和增殖指數(shù)無明顯影響；阻斷ER受體信號后，ICT促分化作用明顯下降(Plt;0.01)；ICT可以提高BMP-2、4 mRNA的表達(Plt;0.01)，但對BMP-7 mRNA無作用(Pgt;0.01)；阻斷ER信號后，ICT 促Smad1/5/8磷酸化明顯減弱(Plt;0.01)。進一步阻斷BMP/Smad信號可以抑制ICT促分化的作用(Plt;0.01)。結論ICT可以通過ER受體激活BMP/Smad信號通路，進而促進MC3T3-E1 subclone 14細胞的分化。

淫羊藿素； 成骨細胞； 受體，雌激素； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白

淫羊藿素(icaritin，ICT)為補腎壯骨中藥淫羊藿的主要成分淫羊藿苷的體內代謝產物，已有研究顯示ICT可以促進成骨細胞(osteoblasts，OB)分化[1]，但對其具體作用靶點和作用機制缺乏進一步研究。傳統(tǒng)認為補腎中藥的黃酮類、香豆素類等活性成分具有類雌激素生物活性，ICT的化學結構上3、7位羥基化使其具有了類雌激素的活性結構，那么ICT影響OB分化是否依賴雌激素受體(estrogen receptor，ER)信號通路？另有研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)/Smad是多種植物活性成分影響OB分化的重要信號通路[2]，ICT是否也是通過BMP/Smad信號轉導途徑促進OB分化，它和ER信號有無關系？本研究以小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14 (MC3T3-E1 subclone 14)為細胞模型，研究ICT對其分化以及ER信號、BMP/Smad信號在其中的作用，為淫羊藿應用于骨質疏松等骨代謝病提供部分細胞分子生物學依據(jù)。

材 料 和 方 法

1主要試劑

無酚紅的αMEM購于Gibco；碳吸附的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購于Biological Industries；抗壞血酸(vitamin C，Vit C)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、茜素紅和對硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)購于Sigma；Triton X-100購于Amresco；ICI182780購于Tocris Cookson；WST-8試劑盒和BrdU流式細胞術細胞增殖檢測試劑盒購于Gemed；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測試劑盒購于凱基生物科技公司；Ⅰ型膠原(ColⅠ)ELISA試劑盒購于森雄科技實業(yè)有限公司；骨鈣素(bone Gla protein，BGP)ELISA試劑盒購于西唐生物科技有限公司；ECL發(fā)光試劑盒購于Pierce；β-tubulin兔抗小鼠 Ⅰ 抗和p-Smad1/5/8多克隆兔抗小鼠 Ⅰ 抗購于Cell Signal；noggin購于Ramp;D；Smad1/5/8多克隆兔抗小鼠 Ⅰ 抗和羊抗兔 Ⅱ 抗購于Santa Cruz公司。

2藥物

淫羊藿素，分子式C21H22O7，分子量386.4，黃色結晶，購于上海順勃生物工程技術有限公司，批號為071201，含量99.8%(HPLC檢測)。

3細胞

MC3T3-E1 subclone 14細胞購于中國科學院細胞庫(ATCC CRL-2594)。

4主要方法

4.1實驗藥物的制備 取ICT 10 mg，先用少量DMSO溶解，然后再配制成含有不同濃度的培養(yǎng)基，對照組培養(yǎng)基中添加同等濃度的DMSO，各實驗組DMSO的量均小于0.1%。

4.2MC3T3-E1 subclone 14細胞培養(yǎng) MC3T3-E1 subclone 14細胞復蘇，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞分化實驗培養(yǎng)液條件為含有10%碳吸附的FBS以去除血清中激素類活性因子、20 mmol/L HEPES、50 mg/L Vit C、1 mmol/L β-甘油磷酸鈉(sodium β-glycerophosphate,β-GP)、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的無酚紅的αMEM培養(yǎng)基[3]，每3 d換液1次。

4.3WST-8檢測細胞活力 細胞每孔5×103個接種至96孔板內，貼壁后換無血清的無酚紅αMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再更換含ICT(0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L)的培養(yǎng)液或對照液(根據(jù)ICT細胞毒性的檢測結果)，培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL的WST-8，孵育1 h，酶標儀490 nm波長處檢測吸光度(A)值。

4.4BrdU法流式細胞儀檢測細胞增殖 細胞每孔2×106個接種至6孔板內，貼壁后換無血清無酚紅的αMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再更換含ICT(0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L)的培養(yǎng)液或對照液48 h，BrdU法流式細胞儀檢測細胞增殖，具體操作按試劑盒步驟進行，波長488 nm氬離子激光器，觀察50 000個細胞以上。

4.5pNPP法檢測細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性 細胞以5×107/L的密度3 mL接種到6孔板中，含10%碳吸附的FBS的αMEM培養(yǎng)6 d，細胞同步化后更換為含藥培養(yǎng)液或對照液，48 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加細胞裂解液1 mL(0.1%Triton X-100)，4 ℃作用20 min，收集裂解液pNPP法測定ALP濃度。BCA法檢測細胞總蛋白進行蛋白濃度校正，ALP活性以103U/g蛋白表示。阻斷ER信號組將細胞用1 μmol/L ICI182780培養(yǎng)基預處理2 h[4]，阻斷BMP信號組將細胞先用100 μg/L noggin培養(yǎng)基預處理2 h[5]，然后分別和藥物共培養(yǎng)。

4.6ELISA法檢測細胞Col Ⅰ和BGP的表達 細胞接種方法同ALP檢測，細胞同步化后更換為含藥培養(yǎng)液或對照液，72 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加細胞裂解液750 μL，裂解20 min，收集裂解液ELISA法測BGP和ColⅠ，包括標準曲線的繪制，加樣，溫育，洗滌，加底物，溫育，加終止液，酶標儀測A值，具體步驟按說明書進行。BCA法檢測細胞總蛋白進行蛋白濃度校正。阻斷ER信號和BMP信號方法同ALP檢測。

4.7茜素紅染色計數(shù)細胞礦化結節(jié) 細胞接種方法同ALP檢測，細胞同步化后更換為各組含藥培養(yǎng)液或對照液，培養(yǎng)14 d后，吸去培養(yǎng)液，95%乙醇固定20 min，吸去固定液，加入0.1%的茜素紅染色液，染色30 min，祛除染色液；在低倍鏡視野(×40)下進行礦化結節(jié)計數(shù)，每孔細胞隨機計數(shù)10個視野的礦化結節(jié)數(shù)。

4.8實時熒光定量PCR檢測BMP-2、BMP-4、BMP-7 mRNA表達 細胞懸液以每瓶2×107接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶內，不同條件干預12 h后，Trizol法提取總RNA，然后逆轉錄；PCR反應；染料法(SYBR Green I)相對定量分析，實驗按照ΔΔCt解析法設計。擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。設定GAPDH為內參照。BMP-2引物序列：正義鏈5’-CAG TAG TTT CCA GCA CCG AAT-3’，反義鏈5’-ATA CTC AGC ACC GGC CTC ACC C-3’，擴增產物長度為646 bp；BMP-4引物序列：正義鏈5’-AAG TTT GTT CAA GAT TGG CTC C-3’，反義鏈5’-CGA CCA TCA GCA TTC GGT TA-3’，擴增產物長度為359 bp；BMP-7引物序列：正義鏈5’-TTC GGA TTG TGC TGT CCA TA-3’，反義鏈5’-GTT TCC CAC ATC AAG CTG GT-3’，擴增產物長度為159 bp；GAPDH引物序列：正義鏈5’-CAC GGC AAA TTC AAC GGC ACA-3’，反義鏈5’-ATA CTC AGC ACC GGC CTC ACC C -3’，擴增產物長度為201 bp。反應結束后根據(jù)Ct值，進行計算和統(tǒng)計。

4.9Western blotting檢測Smad1/5/8的表達 細胞接種方法同ALP檢測，細胞同步化后分成對照組、ICT(1 μmol/L)組、ICI182780(1 μmol/L)組、ICT(1 μmol/L)+ ICI182780(1 μmol/L)組，干預24 h后，檢測Smad1/5/8和磷酸化的Smads1/5/8蛋白的表達。包括：細胞總蛋白的提取，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度確定上樣體積；SDS-PAGE電泳；轉膜、洗膜；免疫反應；分別孵育Ⅰ抗(1∶1 500)和β-tubulin抗體(1∶1 000)，加Ⅱ抗洗膜(1∶3 000)；ECL發(fā)光顯色，曝光，顯影，定影，標定marker，掃描與分析。

5統(tǒng)計學處理

結 果

1ICT對MC3T3-E1subclone14細胞活力和增殖的影響

ICT各組和對照組比較，細胞活力上無顯著差異(Pgt;0.05)；BrdU流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn)ICT各組在培養(yǎng)48 h后，各組增殖指數(shù)(proliferative index，PI)無明顯差異(Pgt;0.05)，見表1。

表1 ICT對MC3T3-E1 subclone 14細胞活力和增殖的影響

2ICT對MC3T3-E1subclone14細胞分化和礦化的影響

和對照組比較，ICT各組ALP活性均明顯升高，差異顯著(Plt;0.01)；0.1 μmol/L和1 μmol/L ICT 濃度組ColⅠ和BGP較對照組均明顯升高，差異顯著(Plt;0.01)；ICT各組細胞形成礦化結節(jié)的數(shù)量較對照組均明顯升高，差異顯著(Plt;0.01)，見表2、圖1。

Figure 1. The microphotographs of mineralized nodus in MC3T3-E1 subclone 14 cells after ICT treatment for 14 d (Alizarin staining,×40).A:control;B:0.01 μmol/L ICT;C:0.1 μmol/L ICT;D:1 μmol/L ICT.

表2 ICT對MC3T3-E1 subclone 14細胞分化和礦化的影響

3阻斷ER信號對MC3T3-E1subclone14細胞分化的影響

和ER阻斷劑ICI182780共同處理后，1 μmol/L ICT促進MC3T3-E1 subclone 14細胞表達ALP、Col I和BGP明顯減少，和單純應用ICT組比較有顯著差異(Plt;0.01)，見表3。

表3 阻斷ER信號對MC3T3-E1 subclone 14細胞分化活性的影響

4ICT對MC3T3-E1subclone14細胞BMP-2、4、7mRNA表達的影響

實時熒光定量檢測相對對照樣品表達量差異(ΔΔCt)顯示ICT可以劑量依賴性地提高BMP-2 mRNA的表達量，各劑量組和對照組以及各劑量組之間差異均顯著(Plt;0.01)，見圖2。用1 μmol/L ICT處理細胞12 h后，也可以提高BMP-4 mRNA的表達量(Plt;0.05)，但對BMP-7 mRNA的表達無明顯影響，見圖3。

5阻斷ER信號對Smad1/5/8活性的影響

Western blotting檢測結果相對分析表明，應用1 μmol/L ICT處理后MC3T3-E1 subclone 14細胞可以使磷酸化的Smad1/5/8表達量升高，和對照組相比有顯著差異(Plt;0.01)。而加入ER阻斷劑ICI182780后Smad1/5/8磷酸化明顯減弱(Plt;0.01)，單純加入ICI182780組磷酸化和對照組比無明顯差異(Pgt;0.05)，因此可以推定BMP/Smad信號可能在ER信號的下游，見圖4、5。

6阻斷BMP信號對MC3T3-E1subclone14細胞分化的影響

和BMP阻斷劑noggin(100 μg/L)共同干預后，1 μmol/L ICT促進MC3T3-E1 subclone 14細胞表達ALP、Col I和BGP明顯減少，與單純應用ICT組比差異明顯(Plt;0.01)，見表4。

Figure 2. MC3T3-E1 subclone 14 cells were treated with different concentrations of ICT for 12 h and the level for BMP-2 mRNA was analyzed by qPCR. ICT increased the mRNA level of BMP-2 in a concentration-dependent manner. ±s.n=6.**Plt;0.01 vs control.

Figure 3. MC3T3-E1 subclone 14 cells were treated with 1 μmol/L ICT for 12 h and the level for BMP-4 and BMP-7 mRNA was analyzed by qPCR. ICT increased the mRNA level of BMP-4 mRNA, but had no effect on BMP-7 mRNA. ±s.n=6..**Plt;0.01 vs control 1.

Figure 4. ICI182780 inhibited the ICT-induced increase in the phosphorylation of Smad1/5/8. MC3T3-E1 subclone 14 cells were pretreated with 1 μmol/L ICI182780 for 2 h and then further incubated with or without ICT for another 24 h. Smad1/5/8 protein phosphorylation was measured by Western blotting, then executed a relative quantitative analysis±s.n=6.**Plt;0.01 vs control;##Plt;0.01 vs ICT treatment alone.

Figure 5. ICI182780 prevented the ICT-induced activation of Smad1/5/8. Cells were treated with 1 μmol/L ICT for 24 h,and ICI182780 1 μmol/L was added 2 h before ICT treatment.

表4 阻斷BMP信號對MC3T3-E1 subclone 14細胞分化活性的影響

討 論

MC3T3-E1 subclone 14和原代培養(yǎng)顱頂OB的行為類似，是研究體外OB分化的較好模型[6-7]，細胞在含有Vit C和β-GP的培養(yǎng)條件中能較好地分化。ICT具有類雌激素的活性結構， 0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L ICT不影響細胞活力和增殖指數(shù)，但可以促進細胞ALP、Col I和BGP的表達，促進礦化結節(jié)的形成，這和一些中藥活性成分的研究類似[5]，國內也有學者發(fā)現(xiàn)染料木黃酮可以劑量和濃度依賴性地提高原代培養(yǎng)的大鼠OB的Col I和BGP的表達[8]。

雌激素通過雌激素受體參與骨骼生理和病理的相關過程，對骨的生長發(fā)育、成熟以及骨量維持有重要意義[9]。雌激素的作用通過雌激素受體ERα和ERβ介導。ICI182780是一種甾體類選擇性雌激素受體調節(jié)劑，是ER的特異性拮抗劑，通過加速ER降解而下調ER、影響ER二聚體化、干擾ER細胞核定位以及減少ER與ERE的結合。ERα和ERβ都同樣對特異性拮抗劑ICI182780反應，ICI182780基本可以完全阻斷雌激素的效應。目前認為，一些中藥有類性激素樣作用，它們的活性成分從化學結構上看大部分具有雌激素的類似結構，因此被稱為植物雌激素(phytoestrogen)[10]，在植物中常以糖苷的形式存在，進入體內經腸道細菌糖苷酶水解為有活性的苷元，可與雌激素受體結合，發(fā)揮雌激素樣作用。ICT就是從淫羊藿苷經腸道內細菌代謝而來，化學結構上3，7位羥基化使其具有了類雌激素的活性結構(圖6)，因此我們推測ICT可能也是通過雌激素受體起作用的，本實驗通過用ICI182780阻斷ER后發(fā)現(xiàn)，ICT促進MC3T3-E1 subclone 14細胞分化作用明顯下降，可見ER介導了ICT的促分化的作用。

Figure 6. Chemical structures of icaritin, 17-β estradiol and ICI182780.

BMPs是脊椎動物體內能誘導成骨的一類酸性多肽，可誘導未定型和定型OB經過趨化、分裂、分化等過程，不可逆地分化成骨。BMP受體屬于TGF-β受體超家族的成員，是膜蛋白受體，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構。在迄今發(fā)現(xiàn)的約20多種BMP成員中，BMP-2、BMP-4和BMP-7在成骨作用方面較為重要[11]。Smads蛋白是BMP在細胞內信號轉導過程中起重要作用的中介因子，其中Smad1、5、8作為信號通路中關鍵分子，通過對多種信號的整合表現(xiàn)為一種總的效應，對靶基因的轉錄進行調節(jié)[12]。一些藥物如FK506可以通過BMP-2/Smad1/5/8調節(jié)干細胞的成骨分化[13]。Noggin是BMP的抑制劑，能夠競爭性與BMPs受體結合，下調BMPs的活性[14]。我們的研究表明ICT可以劑量依賴性地提高BMP-2的表達，對BMP-4也有促進表達的作用，但對BMP-7卻無促進作用，這和一些研究結果如蛇床子素僅刺激BMP-2表達有些不同[2]，我們認為BMP家族多個成員可能參與了ICT對MC3T3-E1 subclone 14細胞的成骨分化。進一步研究發(fā)現(xiàn)阻斷ER信號后，Smad1/5/8的磷酸化明顯減弱，提示ICT能通過ER激活BMP/Smad信號通路。用noggin阻斷BMP/Smad信號后，ICT促進MC3T3-E1 subclone 14細胞分化作用明顯下降，說明BMP/Smad信號通路參與了ICT誘導的MC3T3-E1 subclone 14細胞的成骨分化。

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IcaritininducesdifferentiationofMC3T3-E1subclone14cellsviaestrogenreceptorandBMP/Smadsignalingpathwayinvitro

ZHU Xiao-feng1, ZHANG Rong-hua2, SUN Sheng-yun1, WANG Pan-pan2, YANG Li2, HAN Li1, JIN Ling1

(1DepartmentofTraditionalChineseMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,2PharmacyCollege,JinanUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:tzrh@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effects of icaritin (ICT) on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 subclone 14 cells (a pre-osteoblast cell line) and to observe the role of estrogen receptor (ER) and bone morphogenetic protein(BMP)/Smads signaling pathways in the differentiation of the cells.METHODSThe methods of WST-8 and BrdU were used to observe the viability and proliferation of MC3T3-E1 subclone 14 cells after treatment with different concentrations of ICT. The effects of ICT and noggin on the levels of alkaline phosphatase(ALP), type I collagen (Col I) and bone Gla protein (BGP) in MC3T3-E1 subclone 14 cells were observed after ER was blocked by ICI182780. The relative mRNA levels of BMPs (2, 4, 7) were detected by real-time PCR. The protein phosphorylation of Smad1/5/8 was determined by Western blotting after ER signaling pathway was blocked by ICI182780.RESULTSICT at concentrations of 0.1 μmol/L and 1 μmol/L increased the levels of ALP, Col I and BGP, and the numbers of mineralized nodules in MC3T3-E1 subclone 14 cells, indicating that ICT-promoted the differentiation, but did not affect the cell viability and proliferation. After the ER receptor signaling was blocked, ICT-promoted differentiation was significantly decreased. ICT improved the mRNA expression of BMP-2, 4, but did not affect the mRNA expression of BMP-7. After the ER receptor signaling was blocked, ICT-promoted phosphorylation of Smad1/5/8 was significantly decreased. Blockage of BMP/Smad signaling inhibited the effect of ICT on the differentiation.CONCLUSIONIcaritin induces the differentiation of MC3T3-E1 subclone 14 cells by activating BMP/Smad signaling pathway through ER.

Icaritin; Osteoblasts; Receptors,estrogen; Bone morphogenetic protein

1000-4718(2011)12-2351-06

R336

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.021

2011-07-30

2011-09-19

國家自然科學基金資助項目(No.30772885;No.81173619)；廣東省高等學校中藥有效性與安全性重點實驗室開放基金資助項目(No.kf08011)；廣東中醫(yī)藥局科研基金資助項目(No.2010118)

△通訊作者 Tel: 020-85228578； E-mail: tzrh@jnu.edu.cn