袁偉鋒， 李 理， 徐 虹， 黃文杰△

(1廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 廣東 廣州 510010；2南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院， 廣東 廣州 510515)

·短篇論著·

TNFR-Fc減輕LPS所致小鼠ALI炎癥反應(yīng)損傷*

袁偉鋒1,2， 李 理1， 徐 虹1,2， 黃文杰1△

(1廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 廣東 廣州 510010；2南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院， 廣東 廣州 510515)

目的： 評價(jià)腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白(TNFR-Fc)能否有效下調(diào)炎癥反應(yīng)而減輕急性肺損傷(ALI)小鼠的肺組織破壞。方法小鼠隨機(jī)分為脂多糖(LPS)組、TNFR-Fc+LPS組和對照組。氣管內(nèi)滴入LPS復(fù)制ALI小鼠模型，TNFR-Fc組在滴入LPS前24 h腹膜腔注射TNFR-Fc (0.4 mg/kg)，在滴入LPS后2 h收集標(biāo)本，檢測肺濕/干重、肺泡蛋白含量與肺組織病理評分；ELISA法檢測血清TNF-α濃度及檢測肺泡灌洗液與血清IL-1β、IL-6、IL-10與IFN-γ濃度。結(jié)果TNFR-Fc顯著降低血清TNF-α濃度(Plt;0.05)，輕度降低肺濕/干重比例，顯著降低BALF蛋白濃度(Plt;0.05)，顯著降低ALI評分?jǐn)?shù)值(Plt;0.05)。TNFR-Fc顯著降低致炎癥細(xì)胞因子IL-6在BALF(Plt;0.05)與血清(Plt;0.05)中的濃度，輕度提高BALF中IL-10濃度(Pgt;0.05)，但其差異不顯著，亦能顯著提高血清IL-10濃度(Plt;0.05)。IL-1β與IFN-γ水平處理前后變化不顯著。結(jié)論TNFR-Fc中和ALI中過度表達(dá)的TNF-α，下調(diào)以IL-6為代表的炎癥反應(yīng)，減輕ALI的肺組織破壞。

腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白； 急性肺損傷； 炎癥

細(xì)菌感染后誘發(fā)的炎癥反應(yīng)失衡是引起急性肺損傷(acute lung injury, ALI)的重要因素。炎癥反應(yīng)失控放大、加重了ALI病情，甚至發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征與多器官功能衰竭。因此，ALI的治療不僅需要有效的抗感染療法，而且需要對機(jī)體防御系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，減少炎癥反應(yīng)對肺組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞的破壞，維持呼吸系統(tǒng)功能。在炎癥反應(yīng)始動(dòng)與放大的過程中，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)起著重要作用。TNF-α是啟動(dòng)和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)放大的主要炎癥介質(zhì)。肺泡巨噬細(xì)胞在LPS刺激后初次表達(dá)TNF-α，初次釋放的TNF-α與其它炎癥細(xì)胞的TNF受體(TNF receptor, TNFR)結(jié)合，活化炎癥反應(yīng)信號，正反饋放大炎癥反應(yīng)[1]。中和TNF-α或可抑制炎癥反應(yīng)的放大過程，減輕ALI的炎癥損傷。本研究復(fù)制LPS致ALI小鼠模型，以TNFR-Fc中和循環(huán)過量的TNF-α，通過肺濕/干重比例、肺泡腔蛋白滲出、肺組織病理、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)與血清中多個(gè)炎癥細(xì)胞因子濃度等方面評價(jià)TNF-α中和對ALI的肺組織保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 SPF級8周齡雌性BALB/c小鼠共30只，平均體重20 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有操作和實(shí)驗(yàn)流程均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。小鼠在實(shí)驗(yàn)前自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1.2主要試劑與設(shè)備 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,E.coliO55∶B5, Sigma)；注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白(上海中信國健藥業(yè)有限公司，批號為20090501)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天公司)，小鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-10、TNF-α與干擾素γ(interferon γ,IFN-γ) ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)，電熱烘干箱，酶標(biāo)儀，光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，BX51)。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 30只小鼠隨機(jī)平均分為LPS組、TNFR-Fc+LPS組與對照組。LPS組小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，鈍性分離氣管，氣管內(nèi)滴入LPS(5 mg/kg)。TNFR-Fc+LPS組小鼠腹腔注射TNFR-Fc(0.4 mg/kg)，24 h后如上法進(jìn)行LPS氣管內(nèi)滴入。對照組小鼠氣管內(nèi)滴入與LPS溶液等體積的生理鹽水。分別于LPS/生理鹽水滴入后0 h與2 h處死小鼠獲取檢測樣本。

2.2肺組織濕/干重比例測量 小鼠水合氯醛麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈充分放血，開胸后取肺，濾紙吸干肺表面液體，置電子天平稱量肺組織濕重。稱量濕重后肺置于電熱烘干箱80 ℃干燥48 h后取出，稱量肺組織干重并計(jì)算濕/干重比例。

2.3BALF蛋白含量檢測 小鼠水合氯醛麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈充分放血，剪開頸前皮膚，分離暴露氣管，向心端插入套管針，4 ℃ PBS灌洗3次，共2 mL，計(jì)算總回收率，納入回收率達(dá)80%樣本，5 000 r/min離心10 min，留取上清液，BCA法檢測蛋白含量(操作按試劑盒操作說明進(jìn)行)。

2.4細(xì)胞因子濃度檢測 同上法收集BALF上清液，ELISA法檢測血清TNF-α濃度，以及BALF與血清IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ濃度(操作按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行)。

2.5肺組織病理半定量評分 小鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈充分放血后分離肺組織，置10%中性甲醛中固定。肺組織常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片后行HE染色，參照Mikawa等[2]的方法以4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行肺損傷評分：(1)肺泡充血；(2)出血；(3)間隙或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤或聚集；(4)肺泡間隔增厚或透明膜形成。0分：極輕度損傷；1分：輕度損傷；2分：中度損傷；3分：重度損傷；4分：嚴(yán)重?fù)p傷。將4項(xiàng)指標(biāo)得分相加作為總分。由3名病理科醫(yī)師分別對肺組織損傷程度進(jìn)行評分，取3者平均值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1肺濕/干重比例

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺濕/干重比例在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h與0 h相比均無顯著差異(4.810±0.866vs3.480±0.193；4.700±0.359vs3.700±0.315，Pgt;0.05)。在滴入LPS后2 h，TNFR-Fc+LPS組與LPS組小鼠肺濕/干重比例無顯著差異(4.700±0.359vs4.810±0.866，Pgt;0.05)，見表1。

表1 TNFR-Fc對LPS致ALI小鼠肺濕/干重比例、BALF蛋白含量與肺損傷評分的影響

2肺泡灌洗液蛋白含量

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF蛋白含量在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h與0 h相比均顯著性增高(793.430±87.168vs69.130±19.807，Plt;0.05；519.460±88.579vs77.440±8.533，Plt;0.05)。在滴入LPS后2 h，TNFR-Fc+LPS組BALF蛋白含量顯著低于LPS組(519.460±88.579vs793.430±87.168，Plt;0.05)，見表1。

3肺組織病理評分

在滴入生理鹽水后2 h，對照組小鼠肺泡仍結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡內(nèi)未見水腫液；LPS組小鼠在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h肺組織肺泡間隔增厚并破壞，炎細(xì)胞浸潤，無法辨認(rèn)清晰肺泡結(jié)構(gòu)；TNFR-Fc+LPS組小鼠在氣管內(nèi)滴入LPS后2h肺組織損傷較輕，肺泡間隔增厚，但間隔破壞不明顯，可辨認(rèn)肺泡結(jié)構(gòu)，炎癥細(xì)胞浸潤，主要見于間隔及間隔內(nèi)血管，部分肺泡腔內(nèi)有少量滲出。LPS/生理鹽水滴入后2 h 3組小鼠肺組織病理見圖1。LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織病理評分在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h與0 h相比均顯著升高(LPS組1.600±0.683vs10.000±0.365，Plt;0.05；TNFR-Fc+LPS組1.530±0.650vs6.800±0.901，Plt;0.05)。LPS滴入后2 h，TNFR-Fc+LPS組評分顯著低于LPS組(6.800±0.901vs10.000±0.365，Plt;0.05),見表1。

Figure 1. Lung histology from three group animals (×200).A:control;B:LPS;C:TNFR-Fc+LPS.

4TNFR-Fc中和TNF-α效果檢測

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠血清TNF-α濃度在LPS滴入后2 h與0 h相比均顯著增高[(33.770±13.295)ng/Lvs(634.900±89.082)ng/L，Plt;0.05；(39.530±20.044)ng/Lvs(119.400±50.874)ng/L，Plt;0.05]。在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h，TNFR-Fc+LPS組小鼠血清TNF-α濃度顯著低于LPS組[(119.400±50.874)ng/Lvs(634.900±89.082)ng/L，Plt;0.05],見表2。

表2 TNFR-Fc對LPS致ALI小鼠血清/BALF細(xì)胞因子濃度的影響

5TNFR-Fc對BALF與血清IL-1β濃度的影響

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF的IL-1β濃度在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h與0 h相比無顯著差異(Pgt;0.05)。在滴入LPS后2 h，LPS組與TNFR-Fc+LPS組BALF的IL-1β濃度無顯著差異[(391.670±32.653)ng/Lvs(352.580±66.868) ng/L，Pgt;0.05]。

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-1β濃度在LPS滴入后2 h與0 h相比無顯著差異(Pgt;0.05)。在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h，LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-1β濃度無顯著差異[(66.730±16.716)ng/Lvs(58.590±4.508) ng/L，Pgt;0.05]，見表2。

6TNFR-Fc對BALF與血清IL-6濃度的影響

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF中IL-6濃度在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h與0 h相比均顯著上升[(61.730±15.422)ng/Lvs(1 440.150±184.585)ng/L，Plt;0.05；(60.190±14.273)ng/Lvs(468.370±123.615)ng/L，Plt;0.05]。在滴入LPS后2 h，TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF中IL-6濃度顯著低于LPS組[(468.370±123.615)ng/Lvs(1 440.150±184.585)ng/L,Plt;0.05]。

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-6濃度在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h與0 h相比顯著升高[(20.290±2.246)ng/Lvs(1 739.030±423.206)ng/L，Plt;0.05]；(19.370±2.183)ng/Lvs(1 073.480±156.062)ng/L，Plt;0.05]。在滴入LPS后2 h，TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-6濃度顯著低于LPS組[(1 073.480±156.062)ng/Lvs(1 739.030±423.206) ng/L，Plt;0.05],見表2。

7TNFR-Fc對BALF與血清IL-10濃度的影響

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF中IL-10濃度在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h與0 h相比均無顯著差異(Pgt;0.05)。在滴入LPS后2 h，LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF中IL-10濃度無顯著差異[(264.460±51.147)ng/Lvs(348.520±76.894)ng/L；Pgt;0.05]。

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-10濃度在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h與0 h相比均顯著升高[(211.310±10.753) ng/Lvs(958.130±125.345) ng/L，Plt;0.05；(209.480±10.466) ng/Lvs(1 522.520±86.189) ng/L，Plt;0.05]。在滴入LPS后2 h，TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-10濃度顯著高于LPS組[(1 522.520±86.189) ng/Lvs(958.130±125.345) ng/L，Plt;0.05],見表2。

8TNFR-Fc對BALF與血清IFN-γ濃度的影響

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF中IFN-γ濃度在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h與0 h相比均無顯著改變(Pgt;0.05)。在滴入LPS后2 h，LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF中IFN-γ濃度無顯著差異[(93.680±8.792)ng/Lvs(90.810±13.654)ng/L；Pgt;0.05]。

LPS組小鼠血清IFN-γ濃度在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h與0 h相比無顯著差異[(86.040±6.779)ng/Lvs(107.970±11.920)ng/L，Pgt;0.05]。TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IFN-γ濃度在氣管內(nèi)滴入LPS后2 h與0 h相比顯著升高[(88.130±7.177)ng/Lvs(119.150±16.533)ng/L，Plt;0.05]。在LPS處理后2 h，LPS組小鼠血清IFN-γ濃度與TNFR-Fc+LPS組相比無顯著差異[(107.970±11.920)ng/Lvs(119.150±16.533)ng/L，Pgt;0.05],見表2。

討 論

多種感染因素均可引起ALI，但近年來認(rèn)為ALI的直接原因并不是病原微生物對組織細(xì)胞的直接破壞，而是機(jī)體對病原微生物產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)激，尤其是過度的炎癥反應(yīng)。因此，針對ALI的病理生理過程，進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿庖哒{(diào)控或有助于減輕過度炎癥反應(yīng)對肺組織損傷。

TNF-α是炎癥反應(yīng)激活后迅速釋放的快反應(yīng)炎癥介質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞接受炎癥信號，TNF-α迅速表達(dá)及釋放，初次釋放的TNF-α可與其它炎癥細(xì)胞的TNFR結(jié)合，啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)激，正反饋放大炎癥反應(yīng)[1]。眾多基礎(chǔ)研究支持血清或肺泡灌洗液中TNF-α濃度與ALI嚴(yán)重程度正相關(guān)[3]。中和過高濃度的游離TNF-α，控制炎癥損傷從而降低ALI危害是目前爭議較多的一種治療策略[4,5]。在本研究中，以氣管內(nèi)滴入LPS復(fù)制ALI小鼠模型，采用代表性的TNFR-Fc中和游離TNF-α，評價(jià)中和TNF-α對ALI的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)作用與肺保護(hù)效應(yīng)。

TNFR-Fc是TNFR的膜外區(qū)與IgG的Fc段形成的融合蛋白，能有效降低外周血游離TNF-α濃度，已普遍應(yīng)用于因TNF-α分泌異常引起的免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、Crohn病等[6,7]。在本研究中，提前24 h進(jìn)行TNFR-Fc腹腔內(nèi)注射能有效地降低ALI小鼠血清TNF-α濃度，但仍高于對照組，說明上述TNFR-Fc預(yù)處理未完全清除循環(huán)中的TNF-α，避免了“零濃度”TNF-α導(dǎo)致的免疫功能缺失。同時(shí)，氣管內(nèi)滴入LPS導(dǎo)致明顯的肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺組織大片壞死，大量血管床破壞，而在中和TNF-α后，肺組織病理性破壞顯著減輕，ALI評分下降，客觀地呈現(xiàn)中和TNF-α對肺組織的保護(hù)作用。肺泡蛋白滲出是血管通透性增加的結(jié)果，其變化規(guī)律與病理損傷一致。LPS氣管內(nèi)滴入顯著增高BALF中蛋白濃度，證實(shí)ALI時(shí)有明顯的血管損傷；中和TNF-α則明顯減輕炎癥反應(yīng)引起的血管破壞，蛋白滲出減少。但ALI時(shí)肺水腫程度與肺病理損傷變化不同步。氣管內(nèi)滴入LPS后肺濕/干重比例僅稍有升高，中和TNF-α后肺濕/干重比例僅輕度降低。我們考慮氣管內(nèi)滴入LPS誘導(dǎo)的肺內(nèi)性ALI以肺組織結(jié)構(gòu)破壞為主，肺組織大片壞死，大量血管床破壞，此部分缺乏血管反應(yīng)，炎癥滲出程度較低，因此整體的肺水腫程度增高并不明顯。而給予TNFR-Fc預(yù)處理只能對非壞死區(qū)域的肺組織起作用，部分減輕間質(zhì)水腫。壞死區(qū)域“平均化”了LPS引起的肺間質(zhì)水腫，無法清晰地顯示出中和TNF-α而減輕肺水腫的作用。

IL-6是一個(gè)在ALI的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用的促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)了ALI的組織破壞[8]。IL-6能誘導(dǎo)急性期反應(yīng)蛋白的合成，其血清水平可作為判斷嚴(yán)重感染預(yù)后的指標(biāo)[9]。在本研究中，小鼠在氣管滴入LPS后BALF與血清IL-6水平均迅速升高，而TNFR-Fc預(yù)處理能有效地降低IL-6濃度，提示中和TNF-α有利于下調(diào)炎癥反應(yīng)。IL-1β與IFN-γ是另外兩個(gè)上調(diào)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子。在本研究中，氣管內(nèi)滴入LPS均未明顯增高BALF及血清IL-1β、IFN-γ濃度，而且TNFR-Fc預(yù)處理也未能影響B(tài)ALF及血清IL-1β、IFN-γ濃度，提示TNFR-Fc對炎癥反應(yīng)的干預(yù)并不通過IL-1β或IFN-γ起作用。

IL-10是有顯著炎癥反應(yīng)抑制作用的細(xì)胞因子。在炎癥反應(yīng)激活時(shí)IL-10也隨之表達(dá)。炎癥反應(yīng)激活及免疫細(xì)胞的活化有利于病原微生物的清除，但可能損傷機(jī)體正常細(xì)胞[10]。IL-10能控制炎癥過度放大，避免炎癥反應(yīng)損傷機(jī)體正常組織細(xì)胞。在本研究中，LPS激活炎癥反應(yīng)伴隨血清IL-10濃度升高，TNFR-Fc預(yù)處理使其濃度更高，提示中和TNF-α能有效減低ALI的炎癥反應(yīng)程度。此外，我們發(fā)現(xiàn)無論在BALF中或血清中，LPS均可顯著地升高IL-6與IL-10的比值(本文未顯示此數(shù)據(jù))。以IL-6為代表的促炎因子與以IL-10為代表的抑炎因子比值反映了ALI存在炎癥反應(yīng)失衡——促炎反應(yīng)過度活化與抑炎作用相對不足。而TNFR-Fc預(yù)處理則顯著地降低BALF及血清中IL-6/IL-10比值(本文未顯示此數(shù)據(jù))，提示中和TNF-α、減輕ALI結(jié)構(gòu)細(xì)胞損傷與恢復(fù)促炎反應(yīng)與抑炎癥反應(yīng)的平衡密切相關(guān)。

綜上所述，由LPS誘發(fā)的ALI中存在過度放大的炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)細(xì)胞的損傷。TNFR-Fc通過中和過量的TNF-α，下調(diào)由TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)放大過程，重建以IL-6與IL-10為代表的促炎/抑炎平衡，從而減輕LPS引起的全身與肺局部炎癥反應(yīng)，有效地減輕肺泡滲出與肺組織結(jié)構(gòu)破壞，提示對ALI的病理生理過程進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿庖吒深A(yù)有可能成為治療ALI的新策略。

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ProtectiveroleofTNFR-Fcinmouseacutelunginjuryinducedbylipopolysaccharide

YUAN Wei-feng1,2, LI li1, XU Hong1,2, HUANG Wen-jie1

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China;2PostgraduateInstituteofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:huangyelu1029@vip.163.com)

AIM: Acute lung injury (ALI) is associated with excessive inflammation caused by high tumor necrosis factor α(TNF-α) concentration. We hypothesized that anti-TNF-α therapy would have beneficial effects on mouse ALI model via down-regulating the inflammation.METHODSLipopolysaccharide(LPS,5 mg/kg) was intratracheally administered to BALB/c mice (8～10 weeks old). Twenty-four hours before LPS treatment, the mice were intraperitoneally injected with TNF receptor-Fc fusion protein(TNFR-Fc) once at a dose of 0.4 mg/kg. Wet to dry ratio of the lung tissues and protein concentration in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were detected. The histological changes of the lung tissues were also observed to evaluate lung injury. The concentration of TNF-α in serum as well as interleukin-1β(IL-1β), IL-6, IL-10 and interferon γ(IFN-γ) in BALF and serum were measured by ELISA.RESULTSTNFR-Fc treatment significantly decreased the concentration of serum TNF-α (Plt;0.05), the score of the lung histology and protein concentration in BALF (Plt;0.05). However, the wet to dry ratio of the lung was not obviously changed. The level of IL-6 was decreased both in BALF (Plt;0.05) and in serum (Plt;0.05) after TNFR-Fc treatment. The concentration of IL-10 increased significantly in serum (Plt;0.05) but not in BALF (Pgt;0.05). The concentrations of IL-1β and IFN-γ in BALF and serum were not obviously affected by TNFR-Fc treatment.CONCLUSIONTreatment with TNFR-Fc significantly attenuates LPS-induced ALI via affecting the expression of IL-6 and IL-10.

Tumor necrosis factor receptor-Fc fusion protein; Acute lung injury; Inflammation

1000-4718(2011)12-2387-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.028

2011-04-18

2011-10-09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81070003)

Tel: 020-36653555; E-mail: huangyelu1029@vip.163.com