吳鐵軍, 張麗娜, 亢翠翠

(聊城市人民醫(yī)院ICU，山東 聊城 252000)

Treg/Th17失衡在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中的作用

吳鐵軍, 張麗娜△, 亢翠翠

(聊城市人民醫(yī)院ICU，山東 聊城 252000)

目的： 觀察膿毒癥患者外周血中CD4+CD2+CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及輔助性T細(xì)胞17(Th17)的比例，并探討Treg/Th17失衡在膿毒癥發(fā)病中的作用。方法選擇2010年1～8月入住我院ICU的膿毒癥患者70例，按疾病嚴(yán)重程度分為膿毒癥組(34例)、重癥膿毒癥組(21例)和膿毒癥休克組(15例)。第1 d抽取外周血，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同組別患者外周血中Treg/Th17比例及CD14單核細(xì)胞 HLA-DR表達(dá)率，并探討Treg/Th17比例與免疫狀態(tài)及病情嚴(yán)重程度(APACHEⅡ評(píng)分)的關(guān)系。選取同期健康查體者為對(duì)照組(30例)。結(jié)果(1) 和對(duì)照組相比，各病例組外周血Treg及Th17比例均明顯升高(均Plt;0.01)，但升高的程度不同。Th17表達(dá)以重癥膿毒癥組升高最明顯，Treg表達(dá)以膿毒癥休克組升高最明顯。(2)Treg/Th17：膿毒癥休克組gt;重癥膿毒癥組gt;膿毒癥組，各組兩兩相比均有顯著差異(均Plt;0.01)。膿毒癥組Treg/Th17顯著低于對(duì)照組(Plt;0.01)，膿毒癥休克組Treg/Th17顯著高于對(duì)照組(Plt;0.01)，但重癥膿毒癥組Treg/Th17與對(duì)照組比較無明顯差異。(3)CD14單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)率：膿毒癥休克組lt;重癥膿毒癥組lt;膿毒癥組lt;對(duì)照組，兩兩比較均有顯著差異(均Plt;0.01)。(4)Th17比例和APACHEⅡ評(píng)分及 HLA-DR表達(dá)率無相關(guān)性;Treg表達(dá)率和APACHEⅡ評(píng)分正相關(guān)(r=0.93，Plt;0.01)，和HLA-DR表達(dá)率負(fù)相關(guān)(r=-0.89，Plt;0.01);HLA-DR表達(dá)率和APACHEⅡ評(píng)分負(fù)相關(guān)(r=-0.91，Plt;0.01)。結(jié)論(1)膿毒癥患者中Treg和Th17比例失調(diào)，Treg/Th17的失衡參與膿毒癥的發(fā)病及進(jìn)展。(1)Treg表達(dá)率可以在一定程度上反映機(jī)體病情及免疫狀態(tài)。

膿毒癥； 休克，膿毒性； Th17細(xì)胞; T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性

膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit， ICU)最常見的死亡原因之一，重癥膿毒癥死亡率可高達(dá)60%[1]?，F(xiàn)在人們認(rèn)識(shí)到，膿毒癥觸發(fā)炎癥反應(yīng)的同時(shí)，機(jī)體發(fā)生抗炎反應(yīng)，促炎/抗炎的動(dòng)態(tài)演變決定著膿毒癥的發(fā)展趨勢。近年來Treg及Th17的發(fā)現(xiàn)更新了CD4 T細(xì)胞的內(nèi)容。目前認(rèn)為CD4 T細(xì)胞包括Th1、Th2、Treg、Th17四個(gè)細(xì)胞亞群。Treg/Th17是Th2/Th1的分支，分別起到抗炎和促炎作用。二者失衡導(dǎo)致多種自身免疫疾病及慢性炎癥的發(fā)生[2]。Th2/Th1的漂移決定膿毒癥的發(fā)展，然而Treg/Th17的失衡是否參與膿毒癥的發(fā)病及進(jìn)展，相關(guān)研究較少。本研究通過檢測Treg/Th17及機(jī)體免疫狀態(tài)的變化，探討其在膿毒癥中發(fā)揮的作用。

材 料 和 方 法

1研究對(duì)象

選擇2010 年1～8 月入住我院ICU的膿毒癥患者70例，年齡(53.3±18.2) 歲。門診健康查體者30例作為對(duì)照組。各組間年齡構(gòu)成無顯著差異。膿毒癥、重癥膿毒癥及膿毒癥休克的診斷標(biāo)準(zhǔn)為2001年美國胸科醫(yī)師學(xué)院(American College of Chest Physicians,ACCP)/ 美國危重病醫(yī)學(xué)會(huì)(Society of Critical Care Medicine SCCM)共識(shí)會(huì)議制定[3]。排除以下患者：患有自身免疫系統(tǒng)疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、哮喘等疾病)、急性腦卒中、心肌梗死、病毒性肝炎和人類免疫缺陷病毒(humsan immunodeficiency virus，HIV)感染，入院前3個(gè)月內(nèi)使用過激素或免疫抑制劑。

2方法

2.1標(biāo)本收集 符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者于診斷成立后2 h內(nèi)采靜脈血10 mL，肝素抗凝置于4 ℃冰箱，4 h內(nèi)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)與檢測。同時(shí)計(jì)算APACHEⅡ評(píng)分，即以入院24 h內(nèi)最差生理指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。計(jì)算急性生理學(xué)變量分值、年齡因素分值和慢性健康狀況分值的總和作為APACHEⅡ分值。分值愈高則提示病情愈嚴(yán)重。健康對(duì)照組30例同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17 (1)取留取的肝素鈉抗凝外周靜脈血標(biāo)本5 mL。(2)淋巴細(xì)胞刺激及高爾基體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制：取外周血50 μL，與50 μL RPMI-1640培養(yǎng)基混勻，加入5 μL刺激劑(BD)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激4～6 h。(3)標(biāo)記細(xì)胞膜表面CD3、CD4：取出刺激后的細(xì)胞，混勻，加入CD3 PC5 10 μL、CD4 FITC 20 μL(BD)，避光孵育20 min。(4)破膜：加入破膜固定劑中的1液200 μL，輕微混勻，避光固定15 min，加入2 mL PBS，混勻，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL破膜固定劑中的2液，輕微混勻，靜置5 min。(5)標(biāo)記胞內(nèi)IL-17并標(biāo)記內(nèi)對(duì)照抗體：收集上述細(xì)胞等分為測定管和同型對(duì)照管，測定管加入IL-17A-PE 5 μL(EB)，對(duì)照管加入內(nèi)對(duì)照抗體(IgG1-PE)5 μL，室溫避光孵育30 min，加入2 mL PBS混勻，1 500 r/min離心5 min，棄上清。(6)Th17亞群檢測：BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，以CD3設(shè)門，CD3+、CD4+、IL-17A+為Th17。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg 取留取的肝素鈉抗凝外周靜脈血標(biāo)本2 mL。100 μL抗凝血分別加入細(xì)胞標(biāo)記抗體CD4-ECD-CD25-PC5-CD127-PE及相應(yīng)的同型對(duì)照單抗各10 μL。混勻，溫室避光孵育15 min，加入1.5 mL紅細(xì)胞裂解液?；靹蚝笫覝乇芄夥胖?0 min，破壞紅細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清，每管加入1.5 mL PBS混勻，1 500 r/min離心5 min。棄上清，重復(fù)1次，0.5 mL PBS重懸細(xì)胞。 2 h內(nèi)三色流式細(xì)胞儀檢測。CD4+CD25+CD127-細(xì)胞即為Treg。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測CD14+單核細(xì)胞 HLA- DR表達(dá)率 (1)取流式細(xì)胞檢測管2管 ,分別標(biāo)記 CD14+HLA-DR管及陰性對(duì)照管 ,每管取 100 μL血加入 10 μL CD14-PC5,再分別加入 10 μL HLA- DR-FITC及同型對(duì)照 ,室溫避光染色 15 min。(2)染色后標(biāo)本中加入溶血素 500 μL ,溶血15min。(3)加入 PBS 500 μL,4 ℃保存 ,24 h內(nèi)上機(jī)檢測。(4)以 CD14-PC5設(shè)門 ,檢測 HLA-DR表達(dá)率。(5)所得數(shù)據(jù)經(jīng) EXP OS32 ACD軟件獲取和分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1Treg/Th17的比例

和對(duì)照組相比，膿毒癥患者外周血Treg和Th17比例均明顯升高，但升高的程度不同。其中Th17表達(dá)以重癥膿毒癥患者升高最明顯，而Treg表達(dá)以膿毒癥休克患者升高最明顯，見表1。

2Treg/Th17的平衡狀態(tài)

各病例組Treg/Th17比值不同，膿毒癥休克組gt;重癥膿毒癥組gt;普通膿毒癥組。兩兩相比均有顯著差異，膿毒癥組Treg/Th17顯著低于對(duì)照組，膿毒癥休克組Treg/Th17顯著高于對(duì)照組，但重癥膿毒癥組Treg/Th17與對(duì)照組無明顯差別，見表1。

3膿毒癥患者免疫狀態(tài)的變化

CD14細(xì)胞 HLA-DR表達(dá)率在各組中亦有顯著差異，膿毒癥休克組lt;重癥膿毒癥組lt;膿毒癥組lt;對(duì)照組。兩兩比較均有顯著差異。以HLA-DR表達(dá)率lt;30% 為判斷患者存在免疫抑制的標(biāo)準(zhǔn)，膿毒癥休克患者中存在明顯的免疫抑制，見表1。

4Th17/Treg比例和APACHEⅡ評(píng)分及HLA-DR表達(dá)率的相關(guān)性

Th17比例和APACHEⅡ評(píng)分及 HLA-DR表達(dá)率無顯著相關(guān)，Treg比例和APACHEⅡ評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.93，Plt;0.01)；和HLA-DR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.89，Plt;0.01)。HLA-DR表達(dá)率和APACHEⅡ評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.91，Plt;0.01)。

表1 膿毒癥各組患者Th17/Treg的比例及HLA-DR的表達(dá)

討 論

膿毒癥發(fā)病逐年升高，為ICU最常見的死亡原因之一。膿毒癥并不是一種獨(dú)立疾病，而是包括免疫系統(tǒng)在內(nèi)的多系統(tǒng)共同作用的結(jié)果。免疫機(jī)制在膿毒癥的發(fā)病中越來越受到重視。免疫細(xì)胞Treg、Th17分別起到抗炎和促炎作用。二者均由CD4T細(xì)胞分化而來，Treg表達(dá)Foxp3，通過接觸抑制及釋放抗炎因子IL-10及TGF-β，并通過多種途徑抑制淋巴細(xì)胞反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用[4]。Th17表達(dá)RORγt，分泌IL-17及低水平的TNF-α及IL-6[5]，發(fā)揮促炎反應(yīng)。Treg、Th17功能相反，但關(guān)系密切，相互依存，相互抑制，維持于一種平衡狀態(tài)。Treg/Th17正常值為1.5～2.4,可以反映炎癥反應(yīng)狀態(tài)。升高提示抗炎反應(yīng)占優(yōu)勢，降低提示促炎反應(yīng)占優(yōu)勢。 二者平衡關(guān)系的破壞可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[6]。已有多項(xiàng)研究表明Treg/Th17的失調(diào)和自身免疫疾病及慢性炎癥急性發(fā)作有密切關(guān)系。美國學(xué)者David發(fā)現(xiàn)Treg/Th17的失衡預(yù)示炎癥性疾病惡化[7]。我們的研究表明膿毒癥患者中Treg的表達(dá)水平明顯升高，并且和膿毒癥患者的細(xì)胞免疫呈負(fù)相關(guān)[8]。國外近期研究表明，Treg直接導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖能力下降。2009年我們的研究發(fā)現(xiàn)Th17亦參與膿毒癥的發(fā)生[9]。既然Treg及Th17二者相互制約，關(guān)系密切，又同樣在膿毒癥中異常表達(dá)，那么在膿毒癥中它們之間的平衡狀態(tài)如何，是否影響膿毒癥的進(jìn)展及免疫狀態(tài)，為此我們進(jìn)行了此項(xiàng)研究，并得到部分答案。

我們的研究發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組相比，膿毒癥患者外周血Treg及Th17比例均明顯升高，但升高的程度不同。其中Th17以重癥膿毒癥患者升高最明顯，而Treg以膿毒癥休克患者升高最明顯。說明膿毒癥發(fā)生后機(jī)體發(fā)生強(qiáng)烈的促炎反應(yīng)，患者體內(nèi)Th17表達(dá)增加，抗感染免疫反應(yīng)及清除病原體的能力增強(qiáng)，這是機(jī)體的代償防御反應(yīng)，到重癥膿毒癥階段Th17表達(dá)尤為增高，機(jī)體炎性反應(yīng)達(dá)到最高水平，隨著疾病再一步進(jìn)展，到膿毒癥休克階段Th17細(xì)胞較前下降，機(jī)體清除病原體及抗感染能力下降。在機(jī)體發(fā)生促炎反應(yīng)的同時(shí)，會(huì)代償性出現(xiàn)抗炎反應(yīng)，Th17升高的同時(shí)Treg亦代償性升高。有研究表明，Treg通過細(xì)胞接觸機(jī)制和釋放細(xì)胞因子作用于效應(yīng)T細(xì)胞，發(fā)生免疫抑制，影響Th1/Th2/Th17的極化，決定著炎性反應(yīng)的不同結(jié)局[10]。Treg的升高往往導(dǎo)致免疫麻痹。同樣我們的研究發(fā)現(xiàn)，Treg和APACHEⅡ評(píng)分呈正相關(guān)，和HLA-DR表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)，隨著膿毒癥→重癥膿毒癥→膿毒癥休克病情的加重，Treg逐漸升高，HLA-DR表達(dá)逐漸下降，免疫功能逐漸下降，到膿毒癥休克階段Treg達(dá)最高水平，HLA-DR表達(dá)則達(dá)最低水平，機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制。而國外研究證實(shí)膿毒癥患者發(fā)病后6 h即發(fā)現(xiàn)Th1、 Th2、Treg、Th17 明顯下降[11]?？紤]Treg/Th17比例的升高與其它CD4 T細(xì)胞的下降幅度更大有關(guān)，而并不是由該細(xì)胞的數(shù)量升高所致。

目前關(guān)于膿毒癥發(fā)展的病理生理及分子機(jī)制是當(dāng)膿毒癥發(fā)生后，機(jī)體發(fā)生SIRS(全身炎癥綜合征)的同時(shí)，產(chǎn)生內(nèi)源性代償性抗炎反應(yīng)，即CARS(代償性抗炎反應(yīng)綜合征)，SIRS/CARS保持平衡則內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，不引起器官損傷。當(dāng)二者同樣強(qiáng)烈時(shí)則為具有損傷性混合性拮抗反應(yīng)綜合癥(mixed antagonistic response syndrome,MARS)，二者失衡則導(dǎo)致MODS的發(fā)生。而我們關(guān)于Treg/Th17平衡狀態(tài)的研究對(duì)膿毒癥有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥各組Treg/Th17比值不同，膿毒癥休克組gt;重癥膿毒癥組gt;膿毒癥組。各組兩兩相比均有顯著差異。膿毒癥組Treg/Th17顯著低于對(duì)照組，膿毒癥休克組Treg/Th17顯著高于對(duì)照組，但重癥膿毒癥組Treg/Th17與對(duì)照組無明顯差別。說明當(dāng)膿毒癥發(fā)生后機(jī)體首先以SIRS為主，促炎反應(yīng)占優(yōu)勢，Treg/Th17降低。隨著疾病進(jìn)展，抗炎反應(yīng)也增強(qiáng)，到重癥膿毒癥階段，雖然Treg/Th17和對(duì)照組無異，但其實(shí)是由于促炎和抗炎反應(yīng)同樣強(qiáng)烈，是矛盾下的相對(duì)平衡，也就是MARS，這一時(shí)期患者一旦得不到有效治療，這種平衡便很快會(huì)被打破，發(fā)生MODS。到膿毒癥休克階段Treg/Th17嚴(yán)重失衡，免疫麻痹，甚至死亡。

經(jīng)典治療的失敗使人們認(rèn)識(shí)到免疫水平的調(diào)節(jié)可能成為膿毒癥治療的突破[12]。我們的研究發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞Treg、Th17在膿毒癥的發(fā)病中可能起到重要作用。Treg/Th17失衡參與膿毒癥的發(fā)病過程，影響患者免疫狀態(tài)，進(jìn)一步揭示了膿毒癥的發(fā)病機(jī)理，為其干預(yù)治療提供依據(jù)。

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EffectofdisequilibriumofTreg/Th17inpathogenesisofsepsis

WU Tie-jun, ZHANG Li-na, KANG Cui-cui

(IntensiveCareUnit,LiaochengPeople’sHospital,Liaocheng252000,China.E-mail:zln_109@126.com)

AIM: To investigate the disequilibrium of regulatory T-lymphocytes(Treg) T helper 17 cells (Th17) in sepsis.METHODSSeventy sepsis patients hospitalized in our ICU during January 2010 to August 2010 were enrolled in the study and divided into sepsis group (n=34), severe sepsis group (n=21) and septic shock group (n=15) based on the severity. Serum samples were collected from all the patients on the first day. The percentages of Th17 and Treg and HLA-DR expression in CD14 monocytes were determined by flow cytometry. The relationship between ratio of Treg/Th17, and immune state, pathogenetic severity (score of APACHE II) was also investigated. Thirty matched healthy individuals in the hospital for heath examination in the same period of time served as controls.RESULTSThe percentages of Th17 and Treg were significantly higher in all disease groups than those in control group (allPlt;0.01). The highest percentage of Th17 was observed in severe sepsis group and the highest percentage of Treg was found in septic shock group. The levels of Treg/Th17 ranged as septic shock group gt; severe sepsis groupgt; sepsis group and there was significant difference between every 2 groups (allPlt;0.01). The level of Treg/Th17 was lower in sepsis group and higher in septic shock group than that in control group (Plt;0.01), and no significant difference between severe sepsis group and control group was observed. The HLA-DR expression levels in CD14 monocytes ranged as septic shock group lt; severe sepsis group lt; sepsis group lt; control group, and there was significant difference between every 2 groups (allPlt;0.01). The expression of HLA-DR and score of APACHE II showed no correlation with the percentage of Th17. The percentage of Treg showed positive correlation with the score of APACHE II (r=0.93,Plt;0.01) and negative correlation with the expression of HLA-DR (r=-0.89,Plt;0.01). The HLA-DR expression showed negative correlation with the score of APACHE II (r=-0.91,Plt;0.01).CONCLUSIONThe ratio of Treg to Th17 is abnormal in sepsis patients. The disequilibrium of Treg/Th17 influences the development, of sepsis. To some extent, the level of Treg reflects the pathogenetic conditions and immune state of sepsis patients.

Sepsis; Shock, septic; Th17 cells; T-lymphocytes,regulatory

1000-4718(2011)12-2411-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.034

2011-05-18

2011-10-14

△通訊作者 Tel:0635-8276324； E-mail :zln_109@126.com