李前進(jìn) 馬海樂(lè) 李樹君 李云亮 曲文娟

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，鎮(zhèn)江 212013)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)機(jī)械化科學(xué)研究院2，北京 100083)

脫脂米糠蛋白和多糖的脈沖超聲輔助提取技術(shù)研究

李前進(jìn)1馬海樂(lè)1李樹君2李云亮1曲文娟1

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，鎮(zhèn)江 212013)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)機(jī)械化科學(xué)研究院2，北京 100083)

采用脈沖超聲技術(shù)對(duì)脫脂米糠中蛋白和多糖進(jìn)行同時(shí)提取，研究了液料比、提取時(shí)間、提取溫度、超聲發(fā)出時(shí)間和間歇時(shí)間因素對(duì)蛋白得率和純度以及多糖得率和純度的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box－Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)脈沖超聲輔助提取條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明:脫脂米糠蛋白和多糖的脈沖超聲輔助提取最佳條件為:液料比9.5 mL/g，提取時(shí)間42.6 min，提取溫度51.5℃，超聲發(fā)出時(shí)間4 s，超聲間歇時(shí)間2 s。在此最佳條件下，脫脂米糠蛋白和多糖的得率分別為3.0%和4.6%，純度分別為45.6%和 76.8%。

脫脂米糠 蛋白 多糖 超聲提取 響應(yīng)面

米糠是大米工業(yè)化加工后的主要副產(chǎn)物，我國(guó)是世界上第一產(chǎn)稻大國(guó)，大米年產(chǎn)量約1.85億噸，加工后可得到米糠約1 100萬(wàn)噸［1］，因此進(jìn)行米糠的深加工和綜合利用顯得尤為重要。米糠蛋白中必需氨基酸組成更接近FAO/WHO的推薦模式，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可與雞蛋相媲美。米糠多糖是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜聚糖，由木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖組成［2－3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:米糠多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能等作用［4－5］。米糠多糖一般采用熱水提取或是堿水提取法;米糠蛋白一般采用堿溶提取或是酶解提取法。由于米糠多糖和蛋白與米糠中的纖維和淀粉等成分存在著緊密的結(jié)合，且米糠穩(wěn)定化方法對(duì)蛋白質(zhì)的溶解性有很大的影響，使得米糠中的多糖和蛋白質(zhì)不易被提取出來(lái)，目前存在提取效率不高、純度不高和米糠原料利用不充分等問(wèn)題。米糠多糖和米糠蛋白目前多數(shù)被單獨(dú)提取，利用超聲輔助提取技術(shù)進(jìn)行提取的還處在初始階段。由于米糠中的蛋白和多糖的總量均不超過(guò)5%，分別單獨(dú)提取必然增加了最終產(chǎn)品開發(fā)的成本?；谏鲜龇治觯驹囼?yàn)提取了采用脈沖超聲輔助提取技術(shù)對(duì)脫脂米糠中的多糖和蛋白進(jìn)行同時(shí)提取的研究方案，以提取得率和純度為指標(biāo)，優(yōu)化提取方法。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

脫脂米糠:興化市南亭植物油廠;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和牛白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;濃硫酸、苯酚、三氯乙酸、氫氧化鈉、濃鹽酸、福林酚試劑A和B:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

聚能式超聲輔助提取設(shè)備:無(wú)錫泛博生物工程有限公司;WFJ 7200型可見分光光度計(jì):尤尼柯(上海)儀器有限公司;PHS－3C精密pH計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;AvantiJ－25高速冷凍離心機(jī):Beckman公司;1010－3B型電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米糠蛋白和多糖分離提取的工藝流程

按照設(shè)定的液料比，稱取一定量的脫脂米糠，加入超聲輔助提取器中，加入10 L蒸餾水，系統(tǒng)升溫至設(shè)定的溫度，調(diào)整好超聲發(fā)生器的工作參數(shù)，開啟循環(huán)泵，開始超聲輔助提取。提取結(jié)束后，攪拌均勻的狀況下，取500 mL的提取液加入離心機(jī)在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行固液分離，取上清液真空濃縮至固形物的5%，調(diào)節(jié)至pH 3.5，沉淀蛋白，在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離出沉淀物，干燥得到粗蛋白;取離心上清液100 mL，加入400 mL的乙醇，沉淀多糖，在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離出沉淀物，干燥得到粗多糖。

超聲輔助提取的超聲功率是210 W，提取液以循環(huán)的方式通過(guò)聚能式超聲探頭，循環(huán)泵的流量是7 000 mL/min。超聲波采取間斷脈沖的方式發(fā)出。

1.3.2 測(cè)定方法

蛋白含量的測(cè)定采用福林酚試劑法［6］;多糖含量的測(cè)定采用苯酚硫酸比色法［7］。

蛋白和多糖的得率計(jì)算為干燥后粗蛋白和粗多糖的質(zhì)量與原料質(zhì)量的比值。蛋白和多糖的純度計(jì)算為粗蛋白和粗多糖中的蛋白和多糖含量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)中分別研究了提取時(shí)間、提取溫度、液料比、超聲發(fā)出時(shí)間及超聲間歇時(shí)間因素對(duì)蛋白和多糖提取效率(綜合考慮得率及純度)的影響。

1.3.4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)提取效率影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。采用Box－Benhnken中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以蛋白和多糖的得率作為響應(yīng)值，從而優(yōu)化得出脈沖超聲輔助同時(shí)提取脫脂米糠蛋白和多糖的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 液料比對(duì)蛋白和多糖提取效率的影響

在提取時(shí)間60 min、提取溫度50℃、超聲發(fā)出時(shí)間2 s及超聲間歇時(shí)間2 s的條件下進(jìn)行提取，液料比對(duì)脫脂米糠蛋白和多糖提取效果的影響如圖1所示。

從圖1中可以看出，隨著液料比的不斷增大，除了蛋白質(zhì)得率變化不顯著外，其他指標(biāo)均呈現(xiàn)明顯先上升后下降的趨勢(shì)，在液料比10～15之間，米糠多糖的得率和純度以及蛋白的純度出現(xiàn)了一個(gè)最大值。隨著液料比的提高，一方面因?yàn)槿軇┑娜芙鈩?dòng)力增加，導(dǎo)致提取得率上升，另一方面，因提取液黏度降低，導(dǎo)致超聲空化阻力下降，超聲空化閥降低，有助于超聲輔助提取效果的改善;隨著液料比的進(jìn)一步提高米糠多糖和蛋白的得率應(yīng)該逐步趨于穩(wěn)定，但圖1多糖得率出現(xiàn)下降的原因主要因?yàn)樵囼?yàn)方法所致，因?yàn)槿芤哼^(guò)稀，多糖醇沉?xí)r聚集絮凝的難度加大，引起回收率下降［8］。因此，推薦的液料比為10∶1。

圖1 液料比對(duì)蛋白和多糖得率和純度的影響

2.2 提取時(shí)間對(duì)蛋白和多糖提取效率的影響

在液料比10∶1、提取溫度50℃、超聲發(fā)出時(shí)間2 s及超聲間歇時(shí)間2 s的條件下進(jìn)行提取，提取時(shí)間對(duì)脫脂米糠蛋白和多糖提取效果的影響如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)蛋白和多糖得率和純度的影響

從圖2可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白和多糖不斷溶出，得率和純度均呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)，達(dá)到20 min后，多糖和蛋白的得率趨于穩(wěn)定。蛋白和多糖的純度分別在40 min和60 min后有所下降，主要原因是一些難以溶出的雜質(zhì)逐漸溶出。綜合考慮蛋白和多糖的得率與純度，推薦的提取時(shí)間為40 min。

2.3 提取溫度對(duì)蛋白和多糖提取效率的影響

在液料比10∶1、提取時(shí)間40 min、超聲發(fā)出時(shí)間2 s及超聲間歇時(shí)間2 s的條件下進(jìn)行提取，提取溫度對(duì)脫脂米糠蛋白和多糖提取效果的影響如圖3所示。

圖3 提取溫度對(duì)蛋白和多糖得率和純度的影響

由圖3可以看出，提取溫度對(duì)蛋白和多糖的提取效率影響很顯著，隨著提取溫度的不斷升高，蛋白的得率和純度以及多糖的純度均是先增加后減少，多糖的得率開始時(shí)有個(gè)緩慢下降的趨勢(shì)，之后開始升高，而蛋白的得率在60℃時(shí)出現(xiàn)明顯的下降，這可能是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生了變性，降低了其溶解度，或是達(dá)到了米糠中淀粉的糊化溫度，影響蛋白的溶出。同時(shí)考慮到高溫時(shí)能耗高，所以推薦的提取溫度為不超過(guò)60℃。

2.4 超聲發(fā)出時(shí)間對(duì)蛋白和多糖提取效率的影響

在液料比 10∶1、提取時(shí)間 40 min、超聲溫度50℃、超聲間歇時(shí)間2 s的條件下進(jìn)行提取，超聲發(fā)出時(shí)間對(duì)脫脂米糠蛋白和多糖提取效果的影響如圖4所示。

圖4 超聲發(fā)出時(shí)間對(duì)蛋白和多糖得率和純度的影響

由圖4可以看出，脈沖式超聲波的超聲發(fā)出時(shí)間為4 s時(shí)，蛋白和多糖得率均達(dá)到最大值，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。多糖的純度在2 s和4 s之間出現(xiàn)了一個(gè)峰值，超過(guò)4 s之后開始緩慢的上升，蛋白的純度先緩慢的下降接著又緩慢的上升。綜合考慮，推薦的超聲發(fā)出時(shí)間為4 s。

2.5 超聲間歇時(shí)間對(duì)蛋白和多糖提取效率的影響

在液料比 10∶1、提取時(shí)間 40 min、超聲溫度50℃、超聲發(fā)出時(shí)間4 s的條件下進(jìn)行提取，超聲間歇時(shí)間對(duì)脫脂米糠蛋白和多糖提取效果的影響如圖5所示。

由圖5可以看出，脈沖式超聲波的超聲間歇時(shí)間為2 s的時(shí)候，蛋白和多糖純度均出現(xiàn)了最大值，隨后開始下降，隨著超聲間歇時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，蛋白得率不斷上升，多糖得率緩慢下降，故將超聲間歇時(shí)間選擇在2 s。

圖5 超聲間歇時(shí)間對(duì)蛋白和多糖得率和純度的影響

2.6 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析結(jié)果

2.6.1 模型的建立及顯著性分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù) Box－Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理［9］，選取對(duì)蛋白和多糖提取效率影響顯著的3個(gè)因素:液料比(X1)，提取時(shí)間(X2)，提取溫度(X3)，設(shè)計(jì)一個(gè)3因素3水平的Box－Benhnken中心組合試驗(yàn)，考察3個(gè)因素對(duì)蛋白得率和多糖得率(響應(yīng)值)的影響。Box－Benhnken中心組合設(shè)計(jì)的因素和水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

中心組合試驗(yàn)采取的脈沖式超聲波超聲發(fā)出時(shí)間為4 s、間歇時(shí)間2 s。

表1 Box－Benhnken中心組合設(shè)計(jì)的因素和水平表

表2 Box－Benhnken中心組合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design－Expert 7.1軟件對(duì)試驗(yàn)所得的蛋白得率(Y1)和多糖得率(Y2)分別進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，得到的二次多項(xiàng)式回歸方程如下:

對(duì)回歸方程式(1)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。如表 3 所示，F(xiàn)模型為23.06 大于 F0.01(9，4)=14.66;F失擬為6.52 小于 F0.01(9，4)，這表明建立的二次多項(xiàng)式回歸模型是顯著地，且對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的擬合情況良好，因此該模型可以很好對(duì)脈沖超聲輔助提取脫脂米糠蛋白和多糖試驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，因素X21小于0.000 1，說(shuō)明該因素效應(yīng)極其顯著;X1，X3，X1X2，X1X3和 X23小于 0.05，說(shuō)明這些因素的影響較顯著;X2X3和X22大于0.05，說(shuō)明這兩個(gè)因素的影響不顯著。由此得出:在本試驗(yàn)范圍內(nèi)，液料比和提取溫度對(duì)蛋白得率的影響最大，提取時(shí)間的影響次之。根據(jù)以上分析，剔除其中不顯著因素，得到最終的蛋白得率回歸方程為:

表3 蛋白得率方差分析表

對(duì)回歸方程式(2)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。如表 4 所示，其中 F模型為 22.29 大于 F0.01(9，4)=14.66;F失擬為3.10 小于 F0.01(9，4)，這表明該回歸模型極其顯著，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的擬合情況良好，可以用該方程對(duì)試驗(yàn)真實(shí)值進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。因素X21的影響極顯著;X2，X3，X1X2，X1X3和 X23的影響較顯著，X2X3和X22的影響不顯著。由此得出:本試驗(yàn)的范圍內(nèi)提取時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖得率的影響最大，液料比的影響次之。根據(jù)以上分析，剔除影響不顯著因素，得到最終的多糖得率回歸方程為:

表4 多糖得率方差分析表

2.6.2 Box－Benhnken中心組合試驗(yàn)提取條件的優(yōu)化

利用Design－Expert 7.1軟件的point prediction功能可以預(yù)測(cè)出蛋白和多糖得率兩個(gè)響應(yīng)值均達(dá)到最大時(shí)各因素的最佳值。當(dāng)因子最佳值X1≈9.5，X2≈42.6，X3≈51.5，即液料比為 9.5 mL/g，提取時(shí)間為42.6 min，提取溫度為51.5℃，在此最佳條件下，蛋白和多糖的得率分別為3.0%和4.6%，純度分別為 45.6%和 76.8%。

王莉等［10］研究了米糠多糖的超聲輔助提取技術(shù)，得率為2.87%，比常規(guī)熱水浸提取技術(shù)的2.02%有顯著提高;李東銳等［11］研究了米糠蛋白和多糖的超聲輔助提取技術(shù)，蛋白和多糖得率分別為1%和0.5%。與現(xiàn)有的文獻(xiàn)比較，本研究在超聲功率大幅度減小的基礎(chǔ)上，蛋白和多糖的提取得率得到顯著提高，同時(shí)其純度也比較高。

3 結(jié)論

3.1 液料比、提取時(shí)間和提取溫度是影響米糠多糖和蛋白超聲輔助提取的主要參數(shù)。

3.2 蛋白和多糖得率的回歸方程分別為:

式中:X1為液料比，X2為提取時(shí)間，X3為提取溫度。

3.3 通過(guò)單因素和Box－Benhnken中心組合試驗(yàn)確定了脫脂米糠中蛋白和多糖脈沖超聲輔助提取的最優(yōu)條件為:液料比9.5 mL/g、提取時(shí)間42.6 min、提取溫度51.5℃、超聲發(fā)生時(shí)間4 s和間歇時(shí)間2 s，在此最佳提取條件下蛋白和多糖的得率分別為3.0% 和 4.6%，純度分別為 45.6% 和76.8% 。

［1］馬海樂(lè)，張連波.米糠蛋白的脈沖超聲輔助提取技術(shù)［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，27(1):14－17

［2］姜元榮，姚惠源，陳正行，等.堿溶性米糠多糖的提取及其免疫調(diào)節(jié)功能研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2004，19(6):1－3

［3］Wang M.Preparation and functional proportion of rice bran protein isolate［J］.J.Agric.FoodChem，1999(47):411 －416

［4］Xue － Qiang Zha，Jun － Hui Wang ，Xue － Fei Yang，et al.Antioxidant properties of polysaccharide fractions with different molecular mass extracted with hot－water from rice bran［J］.Carbohydrate Polymers，2009(78):570 － 575

［5］姚惠源，周素梅，王立，等.米糠與米糠蛋白質(zhì)的開發(fā)與利用［J］.無(wú)錫輕工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21(3):312 －316

［6］陳俊輝.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:科學(xué)出版社，2008，65

［7］丁鋼強(qiáng)，于村.食品多糖含量不同測(cè)定方法的研究［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2000(5):325－327

［8］朱黎萍，劉友明，李斌.微波輔助浸提米糠多糖工藝研究［J］.糧食與油脂，2005(12):24 －27

［9］Box G E P，Hunter W G，Hunter J S，et al.Statistics for experiments:an introduction to design Data analysis model building［M］.New York:Wiley，1978

［10］王莉，陳正行，張兵，等.不同方法提取米糠多糖工藝的優(yōu)化研究［J］.食品科學(xué)，2007(4):112－116.

［11］李東銳，蘇明華，汪海波，等.超聲波及勻漿技術(shù)在米糠多糖和米糠蛋白提取中的應(yīng)用研究［J］.糧油加工，2007:1－5.

Study on Pulsed Ultrasound－assisted Extraction of Protein and Polysaccharide from Defatted Rice Bran

Li Qianjin1Ma Haile1Li Shujun2Li Yunliang1Qu Wenjuan1
(School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University1，Zhenjiang 212013)
(Chinese Academy of Agricultural Mechanization Sciences2，Beijing 100083)

The pulsed ultrasonic technology was adopted to extract protein and polysaccharide from defatted rice bran.This research evaluated the effects on the yields and purities of protein and polysaccharide of extraction factors，including liquid to solid ratio，extraction time，extraction temperature，pulsed duration and interval times.Based on the single factor experiment，the response surface analysis was used to optimize the simultaneous extraction condition of protein and polysaccharide by the pulsed ultrasound －assisted extraction.The results showed that the optimum conditions of protein and polysaccharide from defatted rice bran by the pulsed ultrasound－assisted extraction were liquid to solid ratio of 9.5 mL/g，extraction time of 42.6 min，extraction temperature of 51.5 ℃，pulsed duration time of 4 s and pulsed interval time of 2 s.Under the optimum condition，the yields of protein and polysaccharide were 3.0%and 4.6%respectively and their purities were 45.6%and 76.8%respectively.

defatted rice bran，protein，polysaccharide，ultrasonic extraction，response surface analysis

TS201.9

A

1003－0174(2011)08－0005－06

科技部國(guó)際合作項(xiàng)目(2009DFA32000)

2010－10－12

李前進(jìn)，男，1985年出生，碩士，分離提取

馬海樂(lè)，男，1963年出生，教授，博士生導(dǎo)師，分離提取、功能食品