李燕艷 楊 虹 魏婷婷 楊天奎

(豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司分析部，上海 200137)

RP－HPLC法測定食用油中苯并(a)芘的含量

李燕艷 楊 虹 魏婷婷 楊天奎

(豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司分析部，上海 200137)

改進(jìn)了食用油中苯并(a)芘含量的HPLC檢測方法。方法采用Elipse PAH色譜柱，以乙腈－水(88/12，體積比)為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL，以384 nm 為激發(fā)波長，412 nm 為發(fā)射波長測定熒光強(qiáng)度。方法的檢出限為0.4 μg/kg，在0.000 8～0.4 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，回收率在85%以上。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，且前處理簡單，可直接用于食用油中苯并(a)芘含量的檢測。

苯并(a)芘 高效液相色譜 熒光 食用油

苯并(a)芘是有機(jī)物不完全燃燒的產(chǎn)物，為目前世界公認(rèn)的強(qiáng)致癌物質(zhì)之一。苯并(a)芘是一種具有持久性難降解的多環(huán)芳烴，性質(zhì)穩(wěn)定，脂溶性強(qiáng)，因此各種動植物食品，尤其是動植物油脂容易受到苯并(a)芘的污染［1］。食品本身不含或很少含有苯并(a)芘，但是在種植、加工、運(yùn)輸、貯存和烹調(diào)過程中，往往容易受到污染，因此控制苯并(a)芘在動植物食品尤其在食用油中的含量已顯得日益重要。

動植物油脂中苯并(a)芘的檢測在中國國家標(biāo)準(zhǔn)和ISO標(biāo)準(zhǔn)中均有闡述，對于油脂中苯并(a)芘的分離富集等前處理過程，國內(nèi)外文獻(xiàn)也提出了很多先進(jìn)方法，比如基質(zhì)固體分散萃取技術(shù)、固相萃取、咖啡因萃取和超臨界萃取等［2－6］。本研究本著經(jīng)濟(jì)、快速、簡便、可行的宗旨，提出了一種簡單且操作性強(qiáng)的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正己烷、乙腈(色譜純):CNW Technologies GmbH公司;氯化鈉(分析純):上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鉀(分析純):宜興市第二化學(xué)試劑廠;純水、樣品油(椰子油，批號LRSHO－01WS;精煉椰子油，批號SAMPLE－A):自制;苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品(規(guī)格為10 mg):Supelco公司。

Agilent 1200高效液相色譜儀(配四元泵溶劑淋洗系統(tǒng)，自動進(jìn)樣器，熒光檢測器):Agilent公司。

1.2 色譜條件

色譜柱:Elipse PAH，4.6 mm ×250 mm，5 μm;保護(hù)柱:Lichrosorb RP －C18，4.6 mm ×75 mm，5 μm;流動相:乙腈∶水 =88∶12(體積比);流速 1.0 mL/min;柱溫為25℃;檢測器為熒光檢測器，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為384 nm和412 nm。

1.3 樣品溶液的制備

精密稱取樣品1 g，用堿液皂化完全，皂化液冷卻后加入5 mL水，搖勻，加5 mL正己烷提取，共提取3次，合并正己烷層。加飽和食鹽水5 mL進(jìn)一步凈化正己烷層，共凈化3次，收集正己烷層并過濾，濾液室溫真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。準(zhǔn)確加入1 mL乙腈，充分振蕩溶解，取該溶液過濾即得。

1.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取上述1 g樣品，加適量苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3制備方法處理，1.2色譜條件進(jìn)樣，考察色譜方法的系統(tǒng)適用性。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制

用乙腈配制濃度分別為 0.000 8、0.004、0.01、0.02、0.04 μg/mL 的苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取10 μL進(jìn)樣測定，以峰面積 Y對溶液質(zhì)量濃度 X(μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.6 樣品重復(fù)性測定

分別稱取樣品6份，按1.3樣品溶液制備方法處理進(jìn)樣，考察樣品測定重復(fù)性。

1.7 樣品精密度和穩(wěn)定性

取同一樣品在同一天重復(fù)進(jìn)樣8次，每小時進(jìn)樣1次，同時測定出樣品的日間精密度和樣品穩(wěn)定性。

1.8 加標(biāo)回收率的測定

精密稱取樣品9份，按高、中、低3個濃度加入適量苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個濃度3份。

1.9 定量限和檢測限的測定

不斷稀釋苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，得出方法的定量限和檢測限。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜方法適用性

苯并(a)芘在食品中的限度要求非常低［7－8］，因此盡管苯并(a)芘在紫外和熒光下均有吸收，從檢測靈敏度的角度出發(fā)最終選擇熒光作為檢測手段。樣品在上述條件下處理進(jìn)樣，苯并(a)芘峰與前后的干擾峰分離度在1.5以上，且理論塔板數(shù)完全達(dá)到了檢測的要求，表明該色譜方法完全適用于油脂樣品中的苯并(a)芘的檢測(表1)。

表1 樣品中苯并(a)芘檢測的系統(tǒng)適用性數(shù)據(jù)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

對所配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液進(jìn)樣，將所得的峰面積與濃度進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸。苯并(a)芘在濃度為0.000 8～0.4 μg/mL的 范 圍 內(nèi)，標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線:Y=114 128.80X+6.38，(r=0.999 94，n=6)，線性良好。

2.3 日間精密度和重復(fù)性

在上述條件下測定了樣品溶液的日間精密度(8次平行測定)和8 h重復(fù)性(每隔1 h進(jìn)樣)。RSD值為0.43%。說明樣品溶液精密度良好，且在8 h之內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定。2.4 回收率試驗(yàn)

加標(biāo)回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，3個濃度的回收率均在85%～95%，且RSD值小于5%，回收率良好，符合食品行業(yè)要求，方法準(zhǔn)確。

2.5 定量限和檢測限

以信噪比3/1和信噪比10/1分別作為檢測限和定量限，檢測限為 0.4 μg/kg，定量限為 0.8 μg/kg。

3 討論

本方法與國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)方法比較:目前的食用油中苯并(a)芘的檢測主要是熒光分光光度法、高效液相色譜(熒光檢測)法和高效液相色譜(質(zhì)譜檢測)法［9］。難點(diǎn)主要集中在前處理過程中苯并(a)芘的富集和樣品的凈化步驟。ISO 15302:2007和GB/T 22509—2008的前處理過程使用柱層析進(jìn)行樣品凈化，溶劑用量大［10－11］，而且人工裝填層析柱時存在個體差異性，因此重復(fù)性和精密度難以控制(圖1)。GB/T 5009.27—2003中使用液液萃取進(jìn)行前處理，溶劑用量大，分離步驟復(fù)雜，紙層析操作使用了毒性強(qiáng)的苯作為溶劑，且目測法觀測時主觀差異大，靈敏度也不高［12］。另有文獻(xiàn)報(bào)道［3，13］，將樣品經(jīng)液液萃取后，用商品化SPE柱凈化(圖2，圖3)，對花生油、茶油、芝麻油等食用油樣品回收率良好，但在分離凈化某些油品(如椰子油)時出現(xiàn)凈化不干凈的現(xiàn)象。用上述前處理方式與本方法分別處理樣品，對比可見(表2)，本方法凈化干凈，檢測干擾少(圖4)。

圖4 本方法對樣品處理所得色譜圖

表2 本方法與ISO、國標(biāo)及國內(nèi)外文獻(xiàn)的比較

由表2看出目前所使用的操作簡單，方法驗(yàn)證令人滿意，溶劑用量少，檢測成本低，靈敏度高，滿足中國國家標(biāo)準(zhǔn)限度要求和歐盟標(biāo)準(zhǔn)限度要求。

4 結(jié)論

通過利用本方法對椰子油、茶油、花生油和芝麻油等進(jìn)行的檢測，經(jīng)過驗(yàn)證，該方法無明顯干擾雜質(zhì)，回收率好，靈敏度好，準(zhǔn)確性高，大大節(jié)省了檢測成本和檢測時間，是一種檢測食用油中苯并(a)芘含量的良好方法。

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Determination of Benzo(a)pyrene in Edible Oils by Reversed－phase High－performance Liquid Chromatography

Li Yanyan Yang Hong Wei Tingting Yang Tiankui
(Wilmar Biotechnology Research ＆ Development Center(Shanghai)Co.，Ltd.，Shanghai200137)

A method was developed for determination of benzo(a)pyrene in edible oils by HPLC.A elipse PAH HPLC column was used in analysis and acetonitrile/water(88/12，V/V)was taken as a mobile phase.Column temperature was 25 ℃ and the injection volume was 10 μL.Excitation wavelength was 384 nm and emission wavelength 410 nm.The limit of detection was 0.4 μg/kg.It had a good linearity in 0.000 8 ～0.4 μg/mL.Overall recoveries were 85% ～95%.This method was simple，rapid，sensitive and cheap for the assay of benzo(a)pyrene in edible oils.

benzo(a)pyrene，HPLC，fluorescence，edible oil

TS227

A

1003－0174(2011)12－0103－03

2011－01－05

李燕艷，女，1980年出生，工程師，食品分析

楊虹，女，1982年出生，工程師，食品分析