汪鵬榮 蔡琪敏 崔宇輝 蔣冬花 陳丹鳳

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004)

響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲霉胞外多糖提取工藝

汪鵬榮 蔡琪敏 崔宇輝 蔣冬花 陳丹鳳

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004)

對實驗室自行分離得到的紫色紅曲霉MP－66發(fā)酵液中的胞外多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高胞外多糖的產(chǎn)量。通過單因素試驗，研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇沉淀時間、發(fā)酵濾液pH對紅曲霉胞外多糖的得率的影響，并在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計三因素三水平的Box－Behnken中心組合試驗及響應(yīng)面法分析對紅曲霉胞外多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了二次多項式回歸方程的預(yù)測模型，結(jié)果表明:乙醇沉淀時間為16.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，發(fā)酵濾液pH為8.05，在此條件下紅曲霉胞外多糖得率可達(dá)7.40 g/L。

胞外多糖 提取工藝 單因素試驗 響應(yīng)面分析法

紅曲霉是一類十分重要的藥用真菌，紅曲霉發(fā)酵制成的中藥紅曲具有活血化瘀、健脾消食等功效及降脂、降壓、降糖和抗腫瘤等作用［1］，在食品、色素、中藥等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用，隨之紅曲霉的次級代謝產(chǎn)物也成為研究焦點(diǎn)。近年來，日本、美國、韓國等眾多學(xué)者專家對紅曲進(jìn)行了廣泛而深入的研究，并取得了令人矚目的成果。

真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的由10個分子以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子多聚物，是一類可以控制細(xì)胞分裂分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和衰老的活性多糖，是當(dāng)今醫(yī)藥和食品工業(yè)共同關(guān)注的焦點(diǎn)［2］。己在國內(nèi)臨床應(yīng)用的真菌多糖主要有香菇多糖、云芝多糖、云芝糖肽、靈芝多糖、猴頭菌多糖、銀耳多糖等［3］。多糖類物質(zhì)是紅曲霉的一種重要次生代謝產(chǎn)物，已有研究表明紅曲多糖具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等多種生物學(xué)功能［4－6］。目前國內(nèi)研究主要是通過發(fā)酵條件優(yōu)化提高紅曲霉胞外多糖產(chǎn)量［7－9］，但通過胞外多糖提取條件優(yōu)化進(jìn)而提高多糖產(chǎn)量的方法還未見報道。響應(yīng)面法(Response Surface Method，RSM)是一種優(yōu)化提取工藝條件的有效方法，已被廣泛用于同時存在多因素影響的試驗優(yōu)化［10］，其中在微生物多糖和植物多糖的提取研究中應(yīng)用得較為廣泛［11－14］，但在紅曲霉胞外多糖的提取工藝研究方面鮮有報道。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲霉胞外多糖提取工藝參數(shù)，可為后續(xù)紅曲霉胞外多糖的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色紅曲霉(Monascus purpureus)MP－66分離自浙江溫州采集的紅曲米。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 PDA 培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 自然。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖 50 g，蛋白胨 5 g，酵母膏 1 g，KH2PO41 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1 000 mL，pH 6.0。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖50 g/L，蛋白胨20 g/L，KH2PO4·3H2O 10 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，培養(yǎng)基起始 pH 5.5。

施工中嚴(yán)格控制泥漿的密度、粘度、含砂量。造孔過程中，始終保持孔內(nèi)泥漿面在導(dǎo)墻頂面下30～50cm，以防塌孔。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

用打孔器(直徑0.8 cm)分別取30℃培養(yǎng)5 d的平板菌種(5塊)接種到種子培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶裝入50 mL液體培養(yǎng)基)，在30℃下，轉(zhuǎn)速200 r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)48 h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將上述種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為 8%，250 mL三角瓶裝 100 mL培養(yǎng)液，200 r/min，30 ℃培養(yǎng)96 h。

1.3.3 紅曲霉胞外多糖的提取方法［7，15］

將培養(yǎng)96 h的發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，發(fā)酵濾液定容至100 mL，取發(fā)酵濾液20 mL加入80 mL無水乙醇中，在5℃下靜置過夜、離心，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)沖洗，最后在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干至恒重，稱量即為胞外多糖的含量。

1.3.4 多糖提取的單因素試驗

按照乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇沉淀時間、發(fā)酵濾液pH提取紅曲霉胞外多糖，試驗重復(fù)3次，計算平均多糖得率。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇沉淀時間、發(fā)酵濾液pH的3個水平，按Box－Behnken設(shè)計三因素三水平的試驗，并利用響應(yīng)面法對紅曲霉胞外多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇沉淀時間對紅曲霉胞外多糖得率的影響

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，發(fā)酵濾液pH 7.0，分別選取乙醇沉淀時間為4、8、12、16、20 h進(jìn)行單因素試驗，測定多糖得率。由圖1可知，隨著乙醇沉淀時間的增加，胞外多糖得率也隨之提高，但是在16 h之后胞外多糖的得率增加不明顯，這是因為醇析時間過短，乙醇對多糖的沉降會不充分［16］，當(dāng)沉淀時間達(dá)到16 h時發(fā)酵液中的絕大部分多糖均已沉淀出來。因此從時間成本上考慮選取16 h為紅曲霉胞外多糖的最宜提取時間。

圖1 乙醇沉淀時間對多糖得率的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅曲霉胞外多糖得率的影響

設(shè)定乙醇沉淀時間為20 h，發(fā)酵濾液pH 7.0，分別取20 mL發(fā)酵濾液加入無水乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行單因素試驗，測定多糖得率。由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，胞外多糖得率明顯提高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值，乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80%時多糖得率呈下降趨勢。醇沉法提取多糖時，乙醇的體積分?jǐn)?shù)對多糖的提取量影響很大，主要取決于多糖的相對分子質(zhì)量大小和分子的形狀［17］。紅曲霉胞外多糖在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時提取得率最大，葉明等［18］人的研究也證明乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時，黑芝胞外多糖提取得率達(dá)到最大值。因此，紅曲霉胞外多糖提取的最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多糖得率的影響

2.1.3 發(fā)酵濾液pH對紅曲霉胞外多糖得率的影響

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，乙醇沉淀時間為16 h，分別將發(fā)酵液 pH 調(diào)為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0進(jìn)行單因素試驗。由圖3可知，當(dāng)pH小于8.0時，胞外多糖得率隨發(fā)酵濾液pH的增加而增加，當(dāng)pH超過8.0時，多糖得率呈下降趨勢。發(fā)酵液中多糖的沉淀量在偏堿性條件下提取量較大，這可能與其分子帶電荷有關(guān)［17］，因此，弱堿性條件(pH 8.0)更有利于紅曲霉胞外多糖的提取。

圖3 發(fā)酵液pH對多糖提取量的影響

2.2 響應(yīng)面法對紅曲霉胞外多糖提取條件的優(yōu)化

2.2.1 Box－Benhnken試驗設(shè)計與分析

以紅曲霉胞外多糖得率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行相應(yīng)分析試驗，Box－Behnken設(shè)計每個因素取3個水平，以(－1，0，+1)編碼，對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到包括一次項、平方項和交互項的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值［19］。因素水平如表1所示，表2中12組試驗為析因?qū)嶒灒?組為中心試驗。15個試驗點(diǎn)分別為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)位自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗重復(fù)3次，用以估計試驗誤差。

表1 Box－Behnken中心組合試驗設(shè)計因素和水平

表2 Box－Behnken中心組合設(shè)計方案及試驗結(jié)果

2.2.2 回歸方程建立與方差分析

利用Minitab 15軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到紅曲霉胞外多糖得率(Y)對乙醇沉淀時間(X1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X2)和發(fā)酵濾液pH(X3)的二次多項回歸模型為:

Y=0.200X1－0.250X2+0.275X3－0.521X12－0.071X2

2－1.471X32+0.025X1X2－ 0.575X1X3+0.025X2X3+7.267

表3和表4是對方程的方差和回歸分析結(jié)果。表3可知，模型的一次項 X1、X2、X3顯著，其顯著性排序為X3＞X2＞X1即單因素對紅曲霉胞外多糖提取得率的影響大小依次是發(fā)酵濾液pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇沉淀時間;二次項X12和X32顯著，X22不顯著;交互項中X1X3顯著，X2X3和X1X2不顯著。由表4 可知 FModel=40.34，P ＜0.001，表明二次多元回歸模型極顯著;P失擬項=0.06 ＞0.05，說明模擬失擬不顯著;模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.962，表明方程模型與試驗數(shù)據(jù)有96.2%的符合度，該模型有很高的可信度化，可以用此模型對紅曲霉胞外多糖的提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3 回歸分析結(jié)果表

表4 方差分析表

2.2.3 紅曲霉胞外多糖提取得率的響應(yīng)面法分析

響應(yīng)面分析的圖形是特定的響應(yīng)值對應(yīng)自變量構(gòu)成的一個三維空間圖，可以直觀的反映出各自變量對響應(yīng)值的影響［20］。圖5、圖6、圖7為因素交互作用的響應(yīng)面和等高線。響應(yīng)面是響應(yīng)值對各試驗因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，因素對試驗結(jié)果影響越大，表現(xiàn)為曲面越陡峭［21］。等高線的形狀，圓形或者橢圓形可以反映出變量之間的相互影響是否顯著，圓形表示兩因素間交互作用不顯著;而橢圓形則顯著［22］。從圖5、圖6、圖7中可以看出，3個響應(yīng)面均為開口向下的凸行曲線，說明響應(yīng)值(紅曲霉胞外多糖得率)存在極大值。

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時，乙醇沉淀時間與發(fā)酵濾液pH對胞外多糖得率的交互作用見圖5。乙醇沉淀時間一定時，隨著發(fā)酵液pH的增加，胞外多糖產(chǎn)量逐漸增加，在pH 8.0時出現(xiàn)極大值，之后隨著pH的增加，胞外多糖得率呈下降趨勢;乙醇沉淀時間在12～20 h范圍內(nèi)胞外多糖得率變化不太明顯。沿著發(fā)酵濾液pH方向的等高線密度比較大，說明濾液pH對胞外多糖得率的影響大于乙醇沉淀時間。

圖5 乙醇沉淀時間與發(fā)酵濾液pH對胞外多糖得率的響應(yīng)面圖

當(dāng)發(fā)酵濾液pH 8.0時，乙醇沉淀時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)對胞外多糖得率的交互作用見圖6。由圖6可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在70% ～80%范圍內(nèi)，胞外多糖得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80%時，胞外多糖得率開始下降;乙醇沉淀時間在12～16.5 h范圍內(nèi)時，胞外多糖得率隨著沉淀時間的增加而增加，在乙醇沉淀時間為16.5 h時達(dá)到最大值。

圖6 乙醇沉淀時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)對胞外多糖得率的響應(yīng)面圖

當(dāng)乙醇沉淀時間16 h時，乙醇體積分?jǐn)?shù)與發(fā)酵濾液pH對胞外多糖得率的交互作用見圖7。由圖7可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)與發(fā)酵濾液pH分別控制在80%和8.0之內(nèi)時，胞外多糖得率隨著二者濃度的增加而增加，而當(dāng)任一因素高于其相應(yīng)濃度時，胞外多糖得率均將無法達(dá)到最大值。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與發(fā)酵濾液pH對胞外多糖得率的響應(yīng)面圖

為確定各因素的最佳取值，在選取的各因素范圍內(nèi)利用Minitab 15軟件進(jìn)行響應(yīng)優(yōu)化設(shè)計，得出回歸模型存在最大值點(diǎn)，Y的最大值為7.47 g/L，此時對應(yīng)的各因素取值分別為:乙醇沉淀時間為16.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，發(fā)酵濾液pH 8.05。

2.2.4 試驗驗證

為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，采用響應(yīng)面優(yōu)化的工藝條件(乙醇沉淀時間為16.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，發(fā)酵濾液pH 8.05)進(jìn)行紅曲霉胞外多糖提取試驗，試驗重復(fù)3次，所測得的紅曲霉胞外多糖得率的平均值為7.40 g/L，與理論最優(yōu)值(7.47 g/L)僅相差0.94%，可見該模型能較好地預(yù)測紅曲霉胞外多糖的提取情況，證明此次RSM試驗參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇沉淀時間及發(fā)酵濾液pH對紅曲霉胞外多糖得率的影響。由響應(yīng)面分析試驗得出，乙醇沉淀時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)及發(fā)酵濾液pH是影響多糖得率的主要因素，其中發(fā)酵濾液pH的影響最為顯著。依據(jù)回歸分析確定紅曲霉胞外多糖提取的最佳工藝:乙醇沉淀時間為16.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，發(fā)酵濾液pH 8.05。在此工藝條件下，紅曲霉胞外多糖得率可達(dá)7.40 g/L。由此可見，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化紅曲霉胞外多糖的提取工藝條件在實踐上是可靠的。

［1］邢旺興，程榮珍，宓鶴，等.幾種常見紅曲霉的生理學(xué)特性研究［J］.藥學(xué)實踐，2001，19(4):231 －232

［2］郝瑞芳，景浩.真菌多糖的研究進(jìn)展［J］.中國食物與營養(yǎng)，2008，4:19 －20

［3］王舒寧.真菌多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2009，31(3):14 －16

［4］丁紅梅.紅曲多糖抑瘤作用初步研究［J］.菌物研究，2007，5(3):171 －173

［5］曾露燕，趙樹欣，李燚.紅曲霉抑菌成分糖肽類物質(zhì)的分離純化及穩(wěn)定性［J］.天津科技大學(xué)學(xué)報，2009，2(4):18－21

［6］張建峰，昌友權(quán)，陳光，等.紅曲多糖的免疫活性研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(02):391 －393

［7］趙振鋒，方惠英，諸葛健.紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖工藝的優(yōu)化［J］.無錫輕工大學(xué)學(xué)報，2002，2(3):289 －295

［8］李秀巖，魏健，孫振雷.紅曲多糖的提取與發(fā)酵工藝的優(yōu)化［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(21):5653 －5654

［9］李霞姣，夏永軍，王鐵軍，等.紅曲多糖液態(tài)發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化［J］.生物加工過程，2009，7(2):13 －17

［10］吳祥庭，朱濤，鄭巧敏，等.響應(yīng)面法優(yōu)化山藥皮中皂苷提取的研究［J］.中國糧油學(xué)報，2011，26(6):91 －96

［11］Waseem R，Kousar M，Yang W，et al.Optimization，purification，characterization and antioxidant activity of an extracellular polysaccharide produced by Paenibacillus polymyxa SQR－21［J］.Bioresource Technology，2011，102:6095 －6103

［12］Li Jingen，Nie Shaoping，Yang Chao，et al.Extraction optimization，characterization and bioactivity of crude polysaccharides from Herba Moslae［J］.Carbohydrate Polymers，2011，83:1201－1206

［13］高憲軍，王承明，吳媛瑾.酸提棉籽粕多糖工藝研究［J］.中國糧油學(xué)報，2010，9(25):41 －44

［14］Deng Peng，Zhang Guquan，Zhou Bo，et al.Extraction and in vitro antioxidant activity of intracellular polysaccharide by Pholiota adiposa SX －02［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2011，1(111):50 －54

［15］Zhao Liyan，Dong Yanhong，Chen Guitang，et al.Extraction，purification，characterization and antitumor activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80:783 －789

［16］程紅兵，任盛，謝紅，等.細(xì)菌胞外多糖提取優(yōu)化及毒性試驗研究［J］.中國生物工程雜志，2008，28(3):74－78

［17］楊榮玲，陳衛(wèi)東，吳曉玉，等.巴西蟲草胞外多糖提取工藝的優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2007，28(07):91－95

［18］葉明，陳九山，楊柳，等.黑芝胞外多糖提取工藝條件優(yōu)化及體外抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(08):47－50

［19］呂國英，張作法，潘慧娟，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化香菇多糖發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.菌物學(xué)報，2010，29(1):106－112

［20］孫萍萍，王頡，孫劍鋒，等.響應(yīng)面法對縊蟶粗多糖提取工藝的優(yōu)化［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2010，29(4):203 －205

［21］嵇豪，蔣冬花，楊葉，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取紅曲米中水溶性色素［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2011，34(1):91 －96

［22］Muralidhar R V，Chirumamila R R，Marchant R，et al.A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources［J］.Biochemical Engineering Journal，2001，9(1):17 －23.

Optimizing the Extraction Technology of Monascus Exopolysaccharide by Response Surface Methodology

Wang Pengrong Cai Qimin Cui Yuhui Jiang Donghua Chen Danfeng
(College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004)

The extraction conditions for producing exopolysaccharide by Monascus purpureus MP－66 were optimized in order to enhance the extraction yield.Single－factor experiments were carried to investigate the influences of the alcohol volume fraction，the sedimentation time of alcohol，and the pH value of fermentation broth on extraction yield of Monascus exopolysaccharide.On the basis of single － factor experiments，a quadratic polynomial regression equation forecasting model was set up by designing a Box－Behnken central composite experiment involving of three factors and three levels and the method of response surface analysis，thus the optimized extraction conditions for Monascus exopolysaccharide were obtained.According to the results，alcohol sedimentation time was 16.5 h，the alcohol column fraction was 80%，and the pH value of fermentation broth was 8.05.Based on these conditions，the yield of Monascus exopolysaccharide could reach 7.40 g/L.

exopolysaccharide，extraction technology，single factor experiment，response surface methodology

Q939.9

A

1003－0174(2011)12－0083－06

國家自然科學(xué)基金(31070008)

2011－01－18

汪鵬榮，男，1986年出生，碩士，應(yīng)用微生物

蔣冬花，女，1964年出生，教授，微生物學(xué)和植物病理學(xué)