喬 路， 佟 偉 剛， 周 大 勇， 朱 蓓 薇

（1.大連工業(yè)大學 食品學院，遼寧 大連 116034；2.白城市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所，吉林 白城 137000）

0 引 言

鮑（Haliotis）是名貴的水產(chǎn)珍品，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值。長期以來，鮑的加工和食用主要以腹足為主，占鮑總重1／4左右的臟器大部分被丟棄，這不僅會造成環(huán)境污染，同時還是資源的極大浪費。研究表明，皺紋盤鮑臟器中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為40%以上［1］，并含有豐富的精氨酸、谷氨酸、色氨酸等人體所需氨基酸和多種微量元素［2］，具有很大的利用價值。本研究以皺紋盤鮑臟器為原料，優(yōu)化了利用酶法制備鮑魚臟器呈味肽及呈味氨基酸的條件，以期為鮑魚臟器的高值化利用提供新的理論依據(jù)。

1 試 驗

1.1 材料與儀器

鮑魚臟器：大連獐子島漁業(yè)集團股份有限公司提供。試驗所用鮑魚臟器干粉的化學組成：總蛋白57.17%，總糖16.36%，總脂11.5%，水分5.36%，灰分8.68%。

LG-1.0型真空冷凍干燥機，沈陽航天新陽速凍設備制造有限公司；8050 超濾攪拌器，Millipore France；甲醛，大連醫(yī)藥集團化玻公司；三氯乙酸，天津市光復精密化工研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

將新鮮鮑魚臟器洗凈，勻漿，凍干至含水9%以下，粉碎，過20目篩后備用。

1.2.2 鮑魚臟器的蛋白酶酶解

分別用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水解鮑魚臟器干粉，酶解條件見表1。產(chǎn)物用分子質(zhì)量10ku的超濾膜進行超濾分離，取分子質(zhì)量小于10ku的肽組分（AVHs-I）進行后續(xù)試驗。

表1 3種酶的試驗條件Tab.1 Experimental conditions for the three proteases

1.2.3 蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗

中性蛋白酶單因素試驗的基本條件為：酶加量2 500 U／g，反應溫度50 ℃，底物質(zhì)量分數(shù)8%，pH 7.0，水解時間3h。改變其中一個條件，固定其他條件以分別考察酶加量、水解溫度、底物質(zhì)量分數(shù)、pH 和水解時間對水解度的影響。各因素 水 平 梯 度 分 別 為：酶 加 量2 000、2 500、3 000、3 500、4 000U／g；反應溫度35、40、45、50、55 ℃；底物質(zhì)量分數(shù)2%、4%、6%、8%、12%；pH 6.0、7.0、7.5、8.0、8.5；水解時間2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h。水解完成后，在沸水浴中保持10min滅酶，采用甲醛滴定法測定水解度。研究各因素對于中性蛋白酶應選取的大致范圍，并以此為基礎確定響應面各個水平值，從而使得測定結果更加準確、有效、實用。

1.2.3.2 響應面分析

分析單因素試驗結果，將酶解溫度定為45 ℃，時間定為3h，以水解度為指標，做酶加量、pH 值和底物質(zhì)量分數(shù)的三因素三水平中心組合設計響應面試驗［3］。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 化學組成的測定

蛋白質(zhì)的測定：微量凱式定氮法［4］。

總糖的測定：菲林試劑法［5］。

水分的測定：根據(jù)GB／T 5009.3—2003，采用直接干燥法。

脂肪的測定：索氏提取法［6］。

灰分測定：根據(jù)GB／T 5009.4—2003，采用馬弗爐灼燒法。

1.2.4.2 酶活力的測定

采用Folin-酚法測定酶活力［7］。

1.2.4.3 水解度的測定［8］

采用甲醛滴定法［9］測定鮑魚臟器水解液中的酸溶氮的質(zhì)量。

總氮：凱氏定氮法。

水解度=酸溶氮的質(zhì)量／總氮質(zhì)量

1.2.4.4 肽得率的測定

采 用 三 氯 乙 酸（TCA）沉 淀 法［10-11］結 合

FoLin-酚法［12］測定肽得率。

肽得率= （m2-m1）／（m0-m1）

式中，m1為反應前蛋白液中TCA 可溶性蛋白質(zhì)量，mg；m2為蛋白酶解液中TCA 可溶性蛋白質(zhì)量，mg；m0為總蛋白質(zhì)量，mg。

1.2.4.5 谷氨酸等鮮味氨基酸相對質(zhì)量分數(shù)的測定

走過小橋，穿過公路，穿過綠地，看著他們?nèi)松硎殖C健地翻越鐵柵欄，特別是泰森，黑熊一樣笨重的身軀翻越柵欄時像山羊一樣輕捷靈敏。進院子后，他們在一樓的大門口鼓搗了一會兒，門便悄無聲息的打開了?？粗麄冇撵`一般魚貫而入，門悄無聲息的掩上，我突然有了決定——趕快跑！

由軍事醫(yī)學科學院國家生物醫(yī)學分析測試中心色譜實驗室完成。

1.2.5 感官評定分析

采用排序檢驗法［13］測定。

2 結果與討論

2.1 酶的選擇

2.1.1 鮑魚臟器水解產(chǎn)物的水解度及肽得率

根據(jù)表1的試驗條件進行酶解，各酶解產(chǎn)物的主要化學組成以及水解度和肽得率結果如表2所示。

表2 鮑魚臟器3種蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度及肽得率信息Tab.2 Hydrolysis degree and peptide yield derived from abalone viscera digested with the three proteases

從表2中可以看出，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、水解度及肽得率在3個酶解產(chǎn)物中均屬最高，其次是木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物和胰蛋白酶酶解產(chǎn)物。根據(jù)表中數(shù)據(jù)不難發(fā)現(xiàn)，酶解產(chǎn)物的水解度高，其肽得率也高，二者呈正相關。

2.1.2 鮑魚臟器水解產(chǎn)物的鮮味氨基酸

從表3中可以看出，原料中富含天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸等3種鮮味氨基酸。原料經(jīng)水解超濾后，各產(chǎn)物的鮮味氨基酸質(zhì)量分數(shù)會稍有增加。中性蛋白酶酶解產(chǎn)物鮮味氨基酸質(zhì)量分數(shù)明顯高于來源于其他兩個蛋白酶的酶解產(chǎn)物。

表3 鮑魚原料和3種酶解產(chǎn)物AVHs-I的呈味氨基酸組成Tab.3 Flavor amino acid contents of the abalone viscera and the three AVHs-I derived from different proteases

2.1.3 排序檢驗感官評價結果

本試驗將中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶制備的呈味肽及呈味氨基酸按照排序檢驗法進行比較，試驗結果見表4。

對表4進行統(tǒng)計并進行樣品秩次與秩和分析。使用Friedman檢驗，求出統(tǒng)計量F：

式中，J，品評人數(shù)；P，樣品數(shù)；R1，R2，…，RP，每種樣品的秩和。

表4 評價員的評價結果Tab.4 Evaluation results of evaluators

用F 與Friedman 秩和檢驗近似臨界值比較［15］，計算所得F 值大于表中（顯著水平α=0.01）對應的臨界值，即9.75＞9。從而得出結論：中性蛋白酶酶解產(chǎn)物具有更好的口感效果。

崔春等［16］的報道指出，水解度較低時酶解液無明顯風味或以特征苦味為主，如果提高水解度會將大部分蛋白質(zhì)降解為氨基酸和小分子肽，酶解液會呈現(xiàn)出典型的鮮味。同時，蛋白酶的專一性水解與呈味也有很大關系，若水解液以親水性肽為主則呈現(xiàn)鮮味［17］。

中性蛋白酶酶解鮑魚臟器所獲酶解產(chǎn)物的水解度及鮮味氨基酸含量均最高，而且其口感也最好，因此該酶被選為工具酶進行酶解條件的研究。

2.2 工具酶酶解條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

本試驗利用中性蛋白酶作為工具酶，以水解度為指標，得到的單因素試驗結果見圖1。中性蛋白酶在單因素試驗環(huán)節(jié)確定的最適酶加量為3 000U／g，最適酶解溫度為45℃，最適底物質(zhì)量分數(shù)為4%，最適pH 為7.5，最適酶解時間為3h。

2.2.2 響應面分析

以水解溫度、底物濃度和pH 為自變量，以水解度為因變量。用Minitab15軟件設計試驗方案并對試驗結果進行分析，結果見表5。

表5 響應面分析試驗結果Tab.5 Experimental results of response surface methodology

將試驗數(shù)據(jù)輸入軟件可得回歸模型方程：

圖1 中性蛋白酶水解鮑魚臟器的單因素試驗結果Fig.1 Results of single-factor experiment

對回歸方程進行方差分析，結果見表6。模型整體為顯著水平，表明回歸模型與試驗結果數(shù)據(jù)吻合良好。由響應面結果的方差分析可知，方程一次項、二次項的影響都是顯著的，交互項作用影響不顯著，故交互項可以省略，也可以看出各具體試驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系。

通過降維分析方法將多元問題轉化為一元或二元問題，便于分析單因素及雙因素與蛋白水解度的效應關系，并用圖形表示，可獲得形象圖像。將任一因素固定在“0”水平，得到另外兩個因素的交互影響結果，見響應曲面圖2。

表6 回歸方程的方差分析Tab.6 Analysis of variance of regression equation

圖2 3個因素對酶解效果的交互影響Fig.2 Interaction influences of three factors on enzymolysis

比較3組圖可知，影響酶解效果的顯著性大小順序依次為溫度、底物質(zhì)量分數(shù)和pH。

對擬合模型進行響應優(yōu)化，得最優(yōu)酶解條件X1=0.160 9、X2=0.115 8、X3=-0.689 3，即溫度46.0 ℃，底物質(zhì)量分數(shù)3.12%，pH 7.8，酶加量3 000U／g，作用時間3h。在此條件下，理論水解度為29.81%，實測水解度為29.98%。

3 結 論

中性蛋白酶是制備鮑魚臟器呈味肽及呈味氨基酸的最佳工具酶，其酶解產(chǎn)物的水解度及肽得率分別為22.59%和44.96%，其天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸質(zhì)量分數(shù)分別為114.77、142.75 和62.83mg／g。排序檢驗感官評定法確定中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的口感最好。

通過單因素試驗和響應面分析確定中性蛋白酶的最佳酶解工藝條件為：溫度46.0 ℃，底物質(zhì)量分數(shù)3.12%，pH 7.84，加酶量3 000U／g，反應時間3h。在此條件下理論水解度為29.81%，實測水解度為29.98%。

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