孔 玉 瓊， 金 鳳 燮， 魚 紅 閃

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

絞股藍中含有絞股藍皂苷、氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪、黃酮類、糖類、無機元素、纖維素和維生素等多種化學(xué)成分，其中以絞股藍皂苷為主要的藥理活性成分。迄今發(fā)現(xiàn)的絞股藍皂苷達136種，其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)主要是由四環(huán)三萜達瑪烷型絞股藍皂苷元與糖基組成，目前已分離84種與人參皂苷有類似骨架的達瑪烷型絞股藍皂苷（Gypenoside，Gyp）［1-2］。其獨特的生物活性和藥理作用受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，但目前，在我國關(guān)于絞股藍的文獻中，研究絞股藍藥理的占絕大多數(shù)，分子水平的研究尚少，林毅［3］、龐敏［4］等開展過分子水平的研究，但未涉及絞股藍皂苷。本實驗室在前期的工作中已經(jīng)對絞股藍中總皂苷的提取及含量進行了研究并確定了絞股藍總皂苷的最佳提取工藝［5-6］，并利用柱層析法對實驗室自制的絞股藍皂苷的酶解產(chǎn)物進行了分離純化，得到一種單體皂苷Rd［7］。本研究以分離純化得到絞股藍皂苷單體為目的，用硅膠柱層析法對絞股藍總皂苷進行分離純化，以期得到更多絞股藍皂苷單體化合物，為酶學(xué)及藥理藥效等方面的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

絞股藍干草，市售，江蘇泰州；硅膠，青島海洋化工廠；薄層層析板（TLC），Merck公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀；AB-大孔吸附樹脂，D296 陰離子交換樹脂，南開大學(xué)化工廠；所用試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 絞股藍總皂苷的制備

取絞股藍全草5 000g，粉碎機將其粉碎后，分別用10、8、6 倍75%的乙醇浸提3 次，每次提取時間為2d，浸提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低壓蒸干，得浸膏。加適量水溶解后取上清液用石油醚脫脂2～3次，以去除葉綠素等脂溶性物質(zhì)；然后用水飽和正丁醇對脫脂后的上清液萃取皂苷，反復(fù)萃取4～5次，收集正丁醇層，減壓回收正丁醇，濃縮、烘干，得絞股藍粗皂苷。

將經(jīng)飽和正丁醇萃取后的絞股藍粗皂苷溶于純凈水中，反復(fù)上樣，使之充分被吸附后依次用8倍柱體積去離子水脫糖，10%乙醇溶液洗脫除雜后用6倍體積的75%乙醇對皂苷進行解吸；收集洗脫液上D-296離子交換樹脂進行脫色處理，反復(fù)上樣，待吸附完全后用水洗至無含皂苷溶液流出，收集含有皂苷的洗脫液蒸干后制得絞股藍總皂苷粗品。

1.2.2 硅膠柱分離純化絞股藍總皂苷

樣品膠的制備：準確稱取一定量待分離的絞股藍總皂苷，加入適量的甲醇，在60 ℃水浴中完全溶解后，與1.5倍樣品質(zhì)量的80～100目硅膠混合，攪拌均勻，繼續(xù)在水浴中加熱，直至溶劑揮發(fā)干燥后，顆粒均勻而不膩手，即成樣品膠。

裝柱：脫脂棉鋪于玻璃柱底部，取20倍樣品質(zhì)量的300～400目硅膠作為分離膠，鋪放均勻后抽真空壓實，加入一層高2～3cm 的80～100目的硅膠起緩沖作用，再加上已制好的樣品膠，抽真空壓實。最后于最上方鋪脫脂棉，待用。

梯度洗脫：硅膠柱裝好后，先用純氯仿通柱，然后用V（氯仿）∶V（甲醇）=9.5∶0.5的氯仿-甲醇溶液洗脫樣品，每洗脫100mL 收集一瓶，利用薄層層析法對收集的樣品進行跟蹤檢測，根據(jù)TLC情況更換洗脫梯度，分步收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得固體產(chǎn)物。

1.2.3 薄層層析法（TLC）檢測絞股藍皂苷的分離情況

用刻度毛細管吸取標準品及樣品，點樣于薄層層析板上。將點好樣品的薄層板放入層析缸的展開劑中，展開劑配比為V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶3∶0.5，10%硫酸加熱顯色。

1.2.4 高效液相色譜法測定分離單體的純度

利用高效液相色譜儀對分離得到的單體皂苷進行了純度的檢測及皂苷種類的初步鑒定。儀器：Waters2695；色譜柱：Hypersil ODS2（4.6 mm×250mm，5μm）不銹鋼填充柱；進樣量：10μL；體積流量：1.0 mL／min；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈（A）+水（B）梯度洗脫；檢測波長：203nm；洗脫液組成如表1所示。

表1 高效液相色譜流動相組成Tab.1 Mobile phase of HPLC

2 結(jié)果與討論

2.1 絞股藍總皂苷的提取

絞股藍全草5 000g經(jīng)75%乙醇反復(fù)浸提3次后，醇提液經(jīng)石油醚脫脂、飽和正丁醇萃取、AB-8大孔吸附樹脂柱脫糖除雜、D-296離子交換樹脂柱脫色后制得絞股藍總皂苷7.87g，計算得率，得率=提取絞股藍粗皂苷的質(zhì)量／絞股藍全草的質(zhì)量。經(jīng)計算，實驗所得絞股藍總皂苷的得率為0.157 4%。

實驗所得絞股藍皂苷得率較低，分析其原因，除了實驗步驟較多，皂苷損失較大，人為因素的操作失誤、所用絞股藍植物的品種產(chǎn)地［8］也是得率偏低的原因。后期實驗可以考慮使用皂苷含量較高的絞股藍品種以提高得率。

2.2 硅膠柱分離絞股藍皂苷

采用硅膠柱層析法對5g絞股藍總皂苷進行分離，TLC 點板后收集單體產(chǎn)物，稱質(zhì)量，計算得率。

洗脫出的絞股藍單體皂苷按洗脫出現(xiàn)先后分別記為組分A、B、C。

2.2.1 組分A 的分離情況

用V（氯仿）∶V（甲醇）=9.5∶0.5的氯仿-甲醇開始洗脫，薄層層析板點樣跟蹤，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，洗脫至第27瓶的時候，即洗脫至2 700mL 時開始出現(xiàn)單點，從第43瓶開始點的位置開始下移，出現(xiàn)其他皂苷點。收集較純凈的27～42瓶洗脫液，低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得干品組分A，質(zhì)量為0.132 6g。

圖1 組分A 的TLC圖Fig.1 TLC of component A

2.2.2 組分B的分離情況

薄層層析板點樣跟蹤洗脫過程，在V（氯仿）∶V（甲醇）=9∶1時出現(xiàn)組分B，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，洗脫至第11瓶的時候，即洗脫至1 100mL時開始出現(xiàn)較為純凈的單點，且濃度較大，從第16瓶開始點的位置開始下移。收集較純凈的11～15瓶洗脫液，低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得干品組分B，質(zhì)量為0.145 0g。

圖2 組分B的TLC圖Fig.2 TLC of component B

2.2.3 組分C的分離情況

組分C 在V（氯仿）∶V（甲醇）=9∶1 時出現(xiàn)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，洗脫至第27瓶的時候，即洗脫至2 700mL 時開始出現(xiàn)較為純凈的單點，且濃度較大，從第32瓶開始點的位置開始下移。收集較純凈的27～31瓶洗脫液，低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得干品組分C，質(zhì)量為0.261 0g。

圖3 組分C的TLC圖Fig.3 TLC of component C

2.2.4 硅膠柱分離絞股藍皂苷的洗脫條件

將上述所得的3種絞股藍皂苷組分A、B、C進行TLC 檢測，顯示為較干凈的單點，初步判斷為絞股藍單體化合物。圖4為絞股藍總皂苷經(jīng)過硅膠柱分離得到的這3種單體化合物的TLC 檢測結(jié)果。

圖4 絞股藍總皂苷硅膠柱分離成分TLC 檢測結(jié)果Fig.4 TLC for gynostemma pentaphylla sample separated by silica gel column chromatograph

將所得3 種單體皂苷組分使用的洗脫液比例，洗脫體積，所得樣品質(zhì)量及得率整理，結(jié)果如表2所示。

表2 絞股藍皂苷洗脫分離收集表Tab.2 Obtain rate of gypenoside

2.3 絞股藍皂苷單體的HPLC檢測

采用高效液相色譜法檢測絞股藍總皂苷及分離所得單體。精密稱取各樣品3 mL 分別溶于1mL色譜甲醇，完全溶解過0.45μm 微孔濾膜，取濾液，即得3 mg／mL 的供試品。其HPLC 檢測圖譜如圖5所示，3種組分的HPLC 結(jié)果數(shù)據(jù)見表3。

圖5 絞股藍總皂苷及A、B、C組分色譜圖Fig.5 Chromatogram of gypenoside and sample A，B and C

表3 組分A、B、C的HPLC圖譜數(shù)據(jù)Tab.3 Data analysis of sample A，B and C

由圖5和表3可以看出，經(jīng)過硅膠柱的純化后絞股藍單體皂苷A、B、C 均得到了較好的分離純化，較粗品皂苷純度顯著提升。

3 結(jié) 論

通過硅膠柱分離絞股藍皂苷樣品5g，TLC檢測，得到3 種絞股藍皂苷單體，得率分別為2.6%、3.0%、5.2%。高效液相色譜檢測各樣品，相對純度分別約為88.73%、93.11%、78.54%。結(jié)果表明，采用硅膠柱層析法，以氯仿-甲醇混合液為流動相對絞股藍皂苷進行梯度洗脫可以達到分離純化絞股藍總皂苷的目的，在洗脫比例V（氯仿）∶V（甲醇）=9.5∶0.5下洗脫至2 700mL出現(xiàn)較純的單體組分A；9∶1下洗脫至1 100 mL出現(xiàn)較純的單體組分B，洗脫至2 700mL出現(xiàn)較純的單體組分C。這一洗脫比例及洗脫液體積的確定，為大量制備絞股藍多糖基單體皂苷提供了理論依據(jù)，制備中可根據(jù)所需單體皂苷采用相應(yīng)比例洗脫液直接洗脫制備，能有效縮短實驗時間并節(jié)約試劑，提高實驗效率。

［1］侯慧麗，傅童生.絞股藍的化學(xué)成分與藥理作用研究進展［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2006，27（增）：59-61.

［2］CIRCOSTA C，PASQUALE R D，OCCHIUTO F.Cardiovascular effects of the aqueous extract of Gynostemma pentaphyllum Makino［J］.Phytomedicine，2005，12：638-643.

［3］林毅，吳祖建，謝聯(lián)輝，等.抗蟲害基因新資源：絞股藍核糖體失活蛋白基因［J］.分子植物育種，2003，1（5／6）：763-765.

［4］龐敏，鄒芳平，肖婭萍.應(yīng)用RAPD 技術(shù)構(gòu)建絞股藍DNA 指紋圖譜［J］.陜西師范大學(xué)學(xué)報，2006，34（3）：89-93.

［5］沈宏偉，魚紅閃，金鳳燮，等.絞股藍中總皂苷的提取及含量研究［J］.食品科技，2008（4）：158-160.

［6］沈宏偉，魚紅閃，金鳳燮，等.絞股藍皂苷最佳提取條件的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（4）：1332-1336.

［7］YU Hongshan，LIU Hai，ZHANG Chunzhi，et al.Purification and characterization of gypenoside-α-Lrhamnosidase hydrolyzing gypenoside-5into ginsenoside Rd［J］.Process Biochemistry，2004，39：861-867.

［8］覃章錚，趙蕾，畢世榮，等.絞股藍的皂甙成分及資源［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1992，4（1）：83-98.