張 雁， 宋 建 國(guó)， 魚 紅 閃， 金 鳳 燮

（1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 化工與材料學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

三 七［Panax notoginseng （Burk.）F.H.Chen］為五加科人參屬植物，主要分布于我國(guó)云南、貴州、廣西壯族自治區(qū)等省，以根和根莖入藥，是我國(guó)名貴的中藥材。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為三七具有散瘀止血，消腫止痛的功效［1］，現(xiàn)主要用于心腦血管系統(tǒng)疾病的治療。皂苷類成分是三七的主要有效成分，迄今為止已從三七不同部位分離得到單體皂苷70多種［2］。這些皂苷成分大多為達(dá)瑪烷型的20（S）-原人參二醇型和20（S）-原人參三醇型四環(huán)三萜類皂苷，但未發(fā)現(xiàn)含有齊墩果酸型皂苷，這與同屬植物人參和西洋參有顯著區(qū)別［3］。我國(guó)2010年版藥典將人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、三七皂苷Rl作為鑒別三七的指標(biāo)成分［4］。因此，制備可作為對(duì)照品的三七皂苷R1單體對(duì)鑒別三七藥材具有重要意義。近年有文獻(xiàn)報(bào)道，三七皂苷R1對(duì)TNF-α引起的血管內(nèi)皮損傷、過氧化所致大鼠海馬神經(jīng)元損傷有明顯的保護(hù)作用［5-6］，提純?nèi)咴碥誖1對(duì)其藥理作用的進(jìn)一步研究及相關(guān)藥品的研發(fā)生產(chǎn)也具有重要意義。

在本實(shí)驗(yàn)室以往的研究中［7］，利用硅膠柱層析法分離三七中的主要皂苷成分時(shí)，三七皂苷R1和人參皂苷Re、Rd會(huì)被同時(shí)洗脫下來，不能獲得純凈的三七皂苷R1。本研究利用大孔吸附樹脂-硅膠柱層析法分步分離三七總皂苷，達(dá)到提純?nèi)咴碥誖1的目的。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

標(biāo)準(zhǔn)品人參皂苷Rb1、Rd、Re、Rg1、Rh1、三七皂苷R1，由本實(shí)驗(yàn)室提供；三七根，云南省市售產(chǎn)品；大孔吸附樹脂，南開大學(xué)化工廠生產(chǎn)；硅膠，青島海洋化工廠生產(chǎn)；薄層層析板Silica Gel 60-F254，德國(guó)Merck公司生產(chǎn)；高效液相色譜儀，美國(guó)Waters產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析醇。

1.2 方 法

1.2.1 三七總皂苷的提取

稱取一定質(zhì)量的三七根，將其粉碎，加入5倍體積甲醇浸泡3d，適當(dāng)攪拌，濾紙過濾，收集濾液。上述甲醇浸提過程反復(fù)3次，合并提取液，濃縮。濃縮液用石油醚脫脂3次。脫脂后的溶液經(jīng)水飽和正丁醇萃取4次，收集正丁醇相，濃縮干燥成粉末。將干燥粉末溶于75%乙醇后，上D-296大孔吸附樹脂柱，脫色，用10倍柱體積84%乙醇洗脫皂苷，收集洗脫液，濃縮干燥得三七總皂苷。

1.2.2 大孔吸附樹脂-硅膠柱層析法分離提純?nèi)咴碥誖1

稱取一定質(zhì)量的三七總皂苷，用少量75%乙醇完全溶解，加適量去離子水稀釋后，上樣至柱體積為2L的AB-8大孔吸附樹脂柱。待皂苷被充分吸附后，用2倍柱體積的去離子水洗去糖等水溶性雜質(zhì)，依次用10 倍柱體積36%乙醇和5 倍柱體積84%乙醇梯度洗脫皂苷。將兩個(gè)梯度的洗脫液分別收集，濃縮干燥，得含R1的皂苷組分和不含R1的皂苷組分。

稱取一定質(zhì)量含R1的干燥組分，用少量甲醇完全溶解，與80～100目硅膠混合均勻，水浴干燥，制成樣品膠。采用干法裝柱，首先填裝16倍樣品量的分離膠（300～400 目硅膠），真空泵抽實(shí)，再將樣品膠加在分離膠上層，為保持柱面平整，在柱頂覆兩層脫脂棉。以V（氯仿）∶V（甲醇）=8.5∶1.5 做流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，按每瓶250mL收集洗脫液。薄層層析法（TLC）監(jiān)測(cè)洗脫進(jìn)程。根據(jù)TLC 結(jié)果，將相似的組分合并收集，濃縮干燥。

1.2.3 薄層層析法（TLC）

將皂苷溶于甲醇中，用毛細(xì)管吸取少量皂苷溶液，少量多次地點(diǎn)在薄層層析板的起始線上，風(fēng)干后，置于層析缸中展開。展開劑到達(dá)層析板上緣時(shí)，取出，吹干，噴灑10%硫酸水溶液，加熱顯色。參照標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)位置確定樣品中所含皂苷成分。本研究中，檢測(cè)AB-8大孔吸附樹脂柱洗脫結(jié)果時(shí)，TLC展開劑選用V（正丁醇）∶V（乙酸乙酯）∶V（水）=4∶1∶2，此展開劑使R1與Rd的Rf值差值增大，易于辨別分離效果；監(jiān)測(cè)硅膠柱層析洗脫進(jìn)程時(shí)，TLC 展開劑選用V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶3∶0.5。

1.2.4 高效液相色譜法（HPLC）

采用高效液相色譜法檢測(cè)三七皂苷。美國(guó)Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器，Empower 2色譜工作站，Knauer C 18色譜柱（5μm，250mm×3mm）。柱溫35 ℃，體積流量0.6mL／min，按需要配制1mg／mL樣品液，樣品進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)203nm。乙腈-水梯度洗脫，洗脫條件如表1所示。

表1 HPLC洗脫條件Tab.1 The elution requirement of HPLC

2 結(jié)果與討論

2.1 三七根總皂苷的提取

1 000g三七根經(jīng)甲醇浸提，石油醚脫脂，水飽和正丁醇萃取，D-296大孔吸附樹脂脫色，得到三七總皂苷粗品82.0g，得率為8.20%。采用HPLC檢測(cè)三七總皂苷成分及含量。將提取獲得的三七總皂苷粗品配制成2mg／mL甲醇溶液，在“1.2.4”所述的色譜條件下進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，三七根中主要含有Rg1、Rb1、R1、Rd、Re 5 種 皂 苷，另 外 還 含 有 少 量 的Rb3、Rc、Rh1等。按色譜峰面積計(jì)算各種皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如表2所示。

圖1 三七總皂苷HPLC分析圖譜Fig.1 Total ginsenosides in Panax notoginsengon HPLC

表2 三七根中的皂苷成分Tab.2 The proportion of ginsenoside in root of Panax notoginseng

由表2 可知，三七皂苷R1占總皂苷的11.36%。另外，總皂苷中含量最高的是人參皂苷Rg1，占總皂苷的44.15%。

2.2 大孔吸附樹脂-硅膠柱層析法分離提純?nèi)咴碥誖1

稱量80.0g 三七總皂苷粗品，用800 mL 75%的乙醇完全溶解，加去離子水稀釋5倍后，上樣至AB-8大孔吸附樹脂柱，TLC 檢測(cè)樣品吸附完全后，用4L去離子水洗去糖等水溶性雜質(zhì)，依次用20L36%乙醇和10L84%乙醇梯度洗脫皂苷。TLC檢測(cè)兩個(gè)梯度的洗脫液，結(jié)果如圖2所示。將兩個(gè)梯度的洗脫液分別濃縮干燥，稱重得，36%乙醇洗脫下40.0g 皂苷，84%乙醇洗脫下28.0g皂苷。

由圖2可知，36%乙醇主要洗脫下原人參三醇類皂苷Rg1、R1、Re，其中R1和Re的Rf值相近；84%乙醇主要洗脫下原人參二醇皂苷Rb1、Rd和少量的原人參三醇皂苷Rg1、Rh1。表明通過AB-8大孔吸附樹脂梯度洗脫，能將大部分的原人參三醇類皂苷與原人參二醇類皂苷分離，排除了原人參二醇類皂苷Rd對(duì)三七皂苷R1的干擾，為三七皂苷R1的進(jìn)一步分離減少障礙。

稱取上述36%乙醇洗脫組分（即含三七皂苷R1的組分）40.0g，制成樣品膠，采用硅膠柱法進(jìn)一步分離，以V（氯仿）∶V（甲醇）=8.5∶1.5作流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，每瓶收集250mL。薄層層析法監(jiān)測(cè)洗脫進(jìn)程，根據(jù)TLC監(jiān)測(cè)結(jié)果合并收集相似的組分。合并后各組分經(jīng)TLC檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

圖2 AB-8大孔吸附樹脂分離三七總皂苷的TLC圖譜Fig.2 Separation of total ginsenosides by AB-8 macroporous adsorbent resin on TLC

圖3 硅膠柱層析分離三七皂苷R1Fig.3 Separation of notoginsenoside R1by silica gel column on TLC

由圖3可知，3號(hào)組分是較純的三七皂苷R1，4號(hào)組分中主要為三七皂苷R1，混有部分Re；1號(hào)組分主要為Rh1和Rg1，2號(hào)組分為Rg1和R1的混合品，5號(hào)組分主要為Re，混有其他皂苷。將1～5號(hào)組分濃縮干燥，稱量。結(jié)果如表3所示。

表3 洗脫皂苷收集表Tab.3 The separation and elution of saponins

由表3可知，收集編號(hào)為28～32 的3 號(hào)組分，濃縮干燥后得純度較高的三七皂苷R11.27g，占硅膠柱層析樣品量的3.16%，占粗總皂苷的1.55%。

采用HPLC法檢測(cè)三七皂苷R1。取少量硅膠柱層析分離得到的3 號(hào)組分干粉，配制成1mg／mL甲醇溶液，在“1.2.4”所述的色譜條件下進(jìn)行分析，檢測(cè)譜圖如圖4所示。結(jié)果顯示，三七皂苷R1單體純度較高，達(dá)98.48%。

圖4 三七皂苷R1 高效液相色譜圖Fig.4 Notoginsenoside R1on HPLC

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從1 000g三七根中醇提獲得三七總皂苷82.0g，得率為8.20%。高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果表明，三七皂苷R1占三七總皂苷的11.36%。利用大孔吸附樹脂-硅膠柱層析法，對(duì)三七總皂苷進(jìn)行兩步分離。先用10倍柱體積36%乙醇洗脫吸附了80.0g總皂苷的AB-8大孔吸附樹脂柱，得到40.0g含三七皂苷R1的皂苷組分；再將40.0g含三七皂苷R1的皂苷組分用硅膠柱層析法分離，得到三七皂苷R1單體1.27g，占硅膠柱上樣量的3.16%，占三七總皂苷的1.55%，經(jīng)HPLC檢測(cè)三七皂苷R1純度為98.48%。綜上所述，大孔吸附樹脂-硅膠柱層析法能有效地實(shí)現(xiàn)三七皂苷R1單體的分離，達(dá)到提純?cè)撛碥盏哪康摹?/p>

［1］金鳳燮，魚紅閃，張春枝，等.天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009：74-97.

［2］宋建平，曾江，崔秀明，等.三七根莖的化學(xué)成分研究（Ⅱ）［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，29（3）：287-290.

［3］鮑建才，劉剛，叢登立，等.三七的化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.中成藥，2006（2）：46-49.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：11.

［5］ZHANG Hong-sheng，WANG Sheng-qi.Notoginsenoside R1inhibits TNF-α-induced fibronectin production in smooth muscle cells via the ROS／ERK pathway［J］.Free Radical Biology & Medicine，2006，40：1664-1674.

［6］次向明，張秋穎，王忠，等.黃芩苷、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1對(duì)過氧化氫所致大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2004，10（6）：34-36.

［7］石嶺.丹參和三七參成分轉(zhuǎn)化及分離純化的研究［D］.大連：大連工業(yè)大學(xué)，2010.