張花美，朱勝男，張麗莎，施曼玲

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

病毒誘導(dǎo)的基因沉默

張花美，朱勝男，張麗莎，施曼玲*

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

病毒誘導(dǎo)基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)是近年發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，是快速鑒定植物基因功能的一種反向遺傳學(xué)新技術(shù)，近年來成為植物基因功能研究的有力工具.文章從病毒誘導(dǎo)基因沉默的發(fā)現(xiàn)、作用機制、優(yōu)勢、病毒抑制子及其在植物基因功能研究和植物抗病毒的應(yīng)用等方面進行了綜述.

病毒誘導(dǎo)的基因沉默；機制；病毒載體；病毒抑制子；基因功能

RNA介導(dǎo)的基因沉默(RNA-mediated gene silencing)發(fā)生在RNA水平，是一種普遍保守的基于核酸序列的特異性降解機制，并廣泛存在于各種生物中，在動物和線蟲中稱為RNA干涉(RNA-interference, RNAi)，在真菌中稱為基因消除(quelling)，而在植物中稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)[1].病毒誘導(dǎo)的基因沉默( virus-induced gene silencing, VIGS)屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)是細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的mRNA進入細(xì)胞質(zhì)后，由于轉(zhuǎn)入的基因編碼區(qū)與宿主細(xì)胞基因組間存在著同源性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)入基因與內(nèi)源基因的表達(dá)同時受到抑制，這種共抑制是PTGS的普遍現(xiàn)象.具有與病毒基因同源序列的轉(zhuǎn)基因植物，在該病毒侵入植物細(xì)胞后，可在轉(zhuǎn)錄后水平將病毒mRNA降解掉.當(dāng)不被翻譯成衣殼蛋白的病毒mRNA成功克隆到受體植株后，植株具有抵抗該病毒的抗病性，這樣人們首次認(rèn)識到RNA介導(dǎo)的抗病毒性(RNA-mediated virus resistance, RMVR)[2].在此介紹VIGS技術(shù)的發(fā)現(xiàn)、作用機制、優(yōu)缺點、病毒載體、病毒抑制子及VIGS在植物基因功能研究和植物抗病毒等方面的應(yīng)用.

1 病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)的發(fā)現(xiàn)

早在20世紀(jì)20～30年代期間，人們就發(fā)現(xiàn)感染了病毒溫和株系的植株可以抵御隨后的溫和株系及與其親源關(guān)系相近的強毒株系病毒的侵染，即交叉保護現(xiàn)象.進一步研究發(fā)現(xiàn)，交叉保護現(xiàn)象是由于病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生了RNA沉默，使植株產(chǎn)生了對該病毒的抗性，即病毒誘導(dǎo)的基因沉默.后來在轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，即病毒接種的初期，病毒正常增殖，接種葉片表現(xiàn)出被病毒感染的癥狀.但隨著病毒在植株中的系統(tǒng)擴散，植株的新生葉片中雖僅含有少量的轉(zhuǎn)入基因，但表現(xiàn)出對該病毒的抗性[3].1995年，Kumagai 等[4]在煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)中插入了一段八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene desaturase,PDS)cDNA片段，PDS是類胡蘿卜素合成中的一個關(guān)鍵酶，能保護葉綠素免受光漂白.當(dāng)帶有該cDNA片段的TMV重組病毒載體侵染煙草葉片后，葉片變成白色，其原因是PDS基因發(fā)生沉默后，PDS mRNA水平顯著降低，導(dǎo)致類胡蘿卜素合成途徑被阻斷，從而使被侵染植物表現(xiàn)出白化效應(yīng)，可見VIGS可以抑制植物內(nèi)源基因的表達(dá).近年來隨著人們對植物和病毒相互作用機制的進一步研究，VIGS逐漸成為人們用來研究植物基因功能的重要反向遺傳學(xué)手段.

2 病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)的作用機制

圖1 病毒誘導(dǎo)基因沉默模型[10]Fig. 1 The model of virus-induced gene silencing in plant

dsRNA是病毒復(fù)制過程中的中間體，也是基因沉默的關(guān)鍵誘導(dǎo)起始因子.它可以通過RNA自我復(fù)制、病毒復(fù)制機制及hpRNA雙面克隆轉(zhuǎn)基因等方式產(chǎn)生.dsRNA積累到一定程度后會被類似RNAaseⅢ家族的特異性核酸內(nèi)切酶Dicer催化降解成21-25nt的小干擾RNA( small interfering RNA, siRNAs). siRNA大體分為2類：一類是從內(nèi)源的hairpin RNA前體降解而來的21-22nt單鏈小RNA (micro-RNA，miRNA)[5]，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄因子、激素因子和沉默相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[6]；另一類是3′端有2nt突出的21-26nt雙鏈小干擾RNA，作用于系統(tǒng)性基因沉默及同源DNA的甲基化[7].RNA基因沉默的代表性特征是siRNAs的產(chǎn)生[8].此后，siRNA在生物體內(nèi)與RNAase結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex, RISC，由核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、解旋酶等組成，對靶mRNA具有識別和切割作用)，siRNA雙鏈解開，帶有siRNA的RISC能特異性的識別細(xì)胞質(zhì)中靶基因的miRNA及與之同源的基因，導(dǎo)致靶基因mRNA特異降解，從而導(dǎo)致目的基因在mRNA水平上的沉默[9].還有另外一種可能的情況是：帶有siRNA的RISC特異地識別與siRNA高度同源的mRNA序列，并以mRNA為模版，siRNA為引物在RNA聚合酶的作用下合成dsRNA，此雙鏈RNA在下一個循環(huán)中被降解掉，是一個級聯(lián)放大效應(yīng)(如圖1)[10].

3 病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)的優(yōu)缺點

VIGS研究基因組功能的優(yōu)點在于周期短、成本較低、可在不同的遺傳背景下生效，一般從構(gòu)建重組載體到農(nóng)桿菌浸潤接種植物進行功能鑒定只需幾個星期時間，因此既節(jié)省時間又節(jié)省人力和物力，可以較大規(guī)模進行基因組序列的功能鑒定.在篩選植物功能基因上，傳統(tǒng)的方法是通過植物表型突變篩選基因.在擬南芥系統(tǒng)上這是一種有效的方法，但周期長、工作量大、過程繁瑣，而且依賴于植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的成熟度.VIGS能夠快速用于比較物種間多個基因的功能，例如用TRV-VIGS載體研究MAPK和COLL在番茄抗細(xì)菌反應(yīng)和本氏煙抗病毒反應(yīng)中的功能[11-14 ].病毒載體的開發(fā)促進了VIGS技術(shù)的發(fā)展，但也有其不足之處，如對VIGS的研究不夠深入，許多重要的環(huán)節(jié)尚處于不明確階段.另外VIGS的病毒載體有限且有些病毒載體本身也能在植物的生長過程中出現(xiàn)某些癥狀或在生理上產(chǎn)生一些變化，因此在分析VIGS沉默表型時，要注意這些因素對突變表型的干擾[15].因而進一步了解病毒與宿主的相互作用機制，從更深水平上認(rèn)識沉默過程中載體與目的基因的變化規(guī)律對于VIGS系統(tǒng)在植物基因功能上的研究具有非常重要的意義.

4 VIGS病毒載體

病毒載體已成為動植物表達(dá)外源基因的有力工具.據(jù)已發(fā)表的文章，VIGS病毒載體大致分為RNA病毒載體、DNA病毒載體和衛(wèi)星病毒載體等3類.VIGS采用的病毒載體多為RNA病毒載體，RNA病毒載體主要有煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、馬鈴薯X病毒(Potato virus X, PVX)、煙草脆裂病毒(Tobacco Rattle Virus, TRV)以及大麥條紋花葉病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)等.TMV是最早被應(yīng)用于VIGS技術(shù)的病毒載體，它是雙鏈正義RNA病毒，外殼蛋白亞基呈螺旋對稱排列，病毒粒子呈桿狀，其N、C末端都暴露在病毒粒體表面.早期TMV病毒載體都通過CP基因置換外源基因，但多數(shù)情況下載體不能或僅能較低水平表達(dá)外源基因.Kumagai等[16]將另外的病毒CP亞基因組啟動子插入TMV基因組，將外源基因插入此啟動子下游，但由于載體中雙CP亞基因組啟動子序列的高頻同源重組，導(dǎo)致外源基因極易丟失.PVX是應(yīng)用于VIGS技術(shù)的另一個常用病毒載體，它是單鏈正義RNA病毒，外殼蛋白由1400個亞基組裝而成，其N端的33個氨基酸形成β-折疊暴露在CP表面.1998年Ruiz等[17]以PVX為載體，實現(xiàn)了本氏煙PDS基因沉默.TRV是一種單鏈RNA病毒，由RNA1和RNA2組成，Ratciff等[18]構(gòu)建了TRV的RNA1和RNA2 cDNA的雙元表達(dá)載體，并利用TRV載體成功使轉(zhuǎn)基因煙草的綠色熒光蛋白基因沉默.TRV是一類應(yīng)用比較廣泛而且效率和持久性較好的病毒載體，在介導(dǎo)基因沉默的同時不會帶來病毒誘導(dǎo)的癥狀.此外，Holzberg等[19]利用大麥線條花葉病毒( Barley stripe mosaic virus, BSMV) 首次在單子葉植物大麥上成功抑制了PDS基因的表達(dá), 從而為單子葉植物基因功能的研究提供了有效工具.

5 植物病毒抑制子

病毒抑制子蛋白是一種病毒抑制植物PTGS的反防御因子.植物能通過PTGS抵抗病毒侵染,而病毒可以通過抑制PTGS實現(xiàn)對寄主植物的成功侵染[20].目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多種病毒抑制子蛋白[21]，研究比較多的抑制子有HC-Pro、2b和p19.

HC-Pro是一種多功能的蛋白，即作為蚜蟲傳毒的輔助成分又具有蛋白酶活性.它是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的沉默抑制子，其N端的2/3部分是蚜傳輔助因子，而近1/3部分與相鄰的P1蛋白共同行使蛋白水解酶功能，負(fù)責(zé)加工自身蛋白的C端與P3蛋白N端之間的連接.該蛋白不僅能抑制已經(jīng)建立的PTGS，同時能抑制21-23nt的小雙鏈(siRNAs)的積累和基因的甲基化；2b蛋白，黃瓜花葉病毒(CMV)的RNA2的亞基因組RNA4編碼2b蛋白，該蛋白既是運動蛋白，又是致病因子，并抑制信號的產(chǎn)生與傳遞，阻止PTGS擴散到新生的組織中，CMV 2b蛋白具有精氨酸富集的核定位信號(NLS) 22 KRRRRR27，另外利用綠色熒光蛋白進行亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明2b蛋白位于煙草植株細(xì)胞的核內(nèi)，顯然2b介導(dǎo)的PTGS也發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)[22]；P19蛋白，研究較多的是番茄叢矮病毒(TBSV)的P19蛋白, TBSV是正單鏈RNA病毒，它編碼的P19蛋白主要參與病毒的運輸，此蛋白在新生葉片的信號傳導(dǎo)中起作用.

6 病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)的應(yīng)用

6.1 VIGS技術(shù)在植物基因功能研究上的應(yīng)用

VIGS技術(shù)應(yīng)用的領(lǐng)域越來越廣泛，應(yīng)用最多的是鑒定植物功能基因.如應(yīng)用于N基因介導(dǎo)的抗性信號途徑中關(guān)鍵基因功能的研究[15](見表1).

近年，VIGS主要應(yīng)用于本氏煙、番茄、擬南芥、煙草、紅辣椒、罌粟等作物的植物基因功能研究.研究揭示VIGS在植物體的組織和器官中可誘導(dǎo)目標(biāo)基因沉默，如TRV載體能夠在番茄植株的多個部位產(chǎn)生沉默效果，如葉片、花[23]、果實[24]等.Waterhouse等[25]用PVX載體對合成植物細(xì)胞壁纖維素的纖維素合成酶(cellulose synthase genes, CesA)基因進行了研究，結(jié)果表明當(dāng)帶有CesA cDNA目的片段的重組載體浸潤本氏煙后，細(xì)胞壁纖維素的合成能力喪失，并在葉片下表面出現(xiàn)不正常、松散膨脹的球星細(xì)胞，同時整個植株出現(xiàn)矮化現(xiàn)象.宋偉杰等[26]利用一種基于PEBV (Pea early browning virus，PEBV) 的VIGS載體誘導(dǎo)研究一個豌豆PI同源基因的功能.豌豆在其PsPI基因沉默后出現(xiàn)了類似擬南芥pi突變體、金魚草glo突變體的表型，導(dǎo)致其花瓣向萼片以及雄蕊向心皮轉(zhuǎn)變.Wang等[27]將DHS合成酶基因克隆到病毒載體上，利用VIGS將DHS沉默，通過觀察其表型突變來研究該基因的功能.另外，2007年，Nagamatsu等通過CMV載體介導(dǎo)基因沉默研究了大豆發(fā)育過程中的類黃酮基因的功能.眾多的研究表明VIGS技術(shù)是研究植物基因功能快速有效的方法，尤其是對于一些轉(zhuǎn)化困難的非模式植物基因功能的研究更為重要.

表1 利用VIGS鑒定植物功能基因Tab. 1 Identification of functional gene in plants by VIGS

6.2 VIGS在植物抗病毒上的應(yīng)用

植物大多有自己的防御機制，在細(xì)菌感染和抗病毒防御機制中，某些基因起著重要作用，克隆這些基因轉(zhuǎn)化到病毒載體上，通過病毒誘導(dǎo)基因沉默的方法，使病毒不能在植物中積累，從而使轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)抗病毒特性.例如Sainsbury實驗室采用病毒誘導(dǎo)基因沉默的方法，從馬鈴薯中克隆出Rx和Rv兩個抗病基因[28-29].這種利用病毒本身基因?qū)胫参飶亩@得抗病毒植物是植物抗病毒基因工程常用的策略.

7 展 望

VIGS已成為研究基因沉默的熱點，同時也是研究植物基因功能和植物抗病毒的一種有力手段.VIGS載體在VIGS技術(shù)實施過程中起著重要的作用.2004年以前，最穩(wěn)定和有效的VIGS載體只在擬南芥、本氏煙和茄科其他物種如番茄上進行分析一些基因的功能；2004年報道了應(yīng)用于木薯和豌豆等的VIGS載體；2006年后開發(fā)了應(yīng)用于水稻、大豆、玉米等重要經(jīng)濟作物的新載體[30].VIGS也可廣泛用于大規(guī)模篩選，以鑒定感興趣的表型和基因序列的功能.隨著VIGS作用機制深入研究、病毒載體的不斷開發(fā)和利用、適用物種的逐漸增多、以及掌握該技術(shù)研究人員的不斷增加，VIGS將成為基因功能研究和植物功能基因?qū)W研究的最有效工具.

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Virus-InducedGeneSilencing

ZHANG Hua-mei, ZHU Sheng-nan, ZHANG Li-sha, SHI Man-ling

(College of Life and Envionmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Virus-induced gene silencing (VIGS) is a recently discovered post-transcriptional gene silencing. It is a new reverse genetics technique designed to rapidly characterize the functions of plant genes, which is becoming a powerful tool for the study on plant gene functions. The paper reviewed the discovery, mechanism, advantage, viral suppressor of VIGS and its applications in the researches on the plant gene functions as well as the plant virus-resistance.

virus-induced gene silencing; mechanism; virus vector; viral suppressors; gene function

10.3969/j.issn.1674-232X.2011.02.014

2010-07-02

張花美(1985—)，女，山東棗莊人，遺傳學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事植物病毒與分子生物學(xué)研究.

*通信作者：施曼玲(1969—)，女，福建福鼎人，教授，博士，主要從事植物病毒與分子生物學(xué).E-mail: smiling1969@163.com

Q945.8

A

1674-232X(2011)02-0158-05