李瑾翡，梁 祈，黎（廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州市 510180）

中圖分類號R927.1；R975+.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1001-040（82011）05-0437-03

“齊二藥”亮菌甲素注射液毒性物質(zhì)篩查研究Δ

李瑾翡＊，梁 祈，黎（廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州市 510180）

中圖分類號R927.1；R975+.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1001-040（82011）05-0437-03

目的：對“齊二藥”事件中亮菌甲素注射液進(jìn)行毒性物質(zhì)篩查研究，尋找發(fā)生原因及建立相關(guān)的應(yīng)急檢驗(yàn)方法。方法：對“齊二藥”與大理藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的亮菌甲素注射液進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)（半數(shù)致死量LD50）比較；對亮菌甲素注射液中輔料聚乙二醇400進(jìn)行小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)，篩查正常的輔料是否含有毒性物質(zhì)；用氣相色譜法測定2個廠家產(chǎn)品中二甘醇的含量，并用氣-質(zhì)聯(lián)用色譜法對“齊二藥”亮菌甲素注射液中二甘醇進(jìn)行成分確證。結(jié)果：2個廠家的亮菌甲素注射液LD50分別為17.72、21.06mL·kg－1，二甘醇含量分別為293mg·mL－1、未檢出；聚乙二醇400小鼠組均存活，并表現(xiàn)正常；氣-質(zhì)聯(lián)用色譜法證實(shí)“齊二藥”亮菌甲素注射液中含有二甘醇。結(jié)論：確認(rèn)“齊二藥”亮菌甲素注射液毒性增大是由二甘醇引起的；利用動物實(shí)驗(yàn)對毒性物質(zhì)進(jìn)行篩查可用于藥品質(zhì)量的應(yīng)急檢驗(yàn)。

“齊二藥”事件；亮菌甲素注射液；毒性物質(zhì)；二甘醇；應(yīng)急檢驗(yàn)

亮菌甲素注射液在臨床上主要用于急、慢性肝炎及膽道疾病的治療，其處方組成為亮菌甲素、丙二醇、聚乙二醇400、聚山梨酯-80。2006年5月2日，廣東省不良反應(yīng)監(jiān)測中心接廣州市不良反應(yīng)監(jiān)測中心報告，中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院出現(xiàn)8例疑似急性腎功能衰竭患者，這些患者均使用了齊齊哈爾第二制藥廠（以下簡稱齊二藥）生產(chǎn)的亮菌甲素注射液，這就是震驚全國的“齊二藥”假藥事件。為快速查明發(fā)生不良反應(yīng)原因，筆者當(dāng)時首先對“齊二藥”和大理藥業(yè)有限公司（以下簡稱大理藥業(yè)）生產(chǎn)的亮菌甲素注射液和相關(guān)輔料進(jìn)行了毒性篩查實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)毒性篩查結(jié)果以及按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。另又溯源追蹤，根據(jù)其輔料之一聚乙二醇400在質(zhì)量控制中需要對二甘醇和乙二醇含量進(jìn)行控制的要求，以及二甘醇在歷史上多次發(fā)生藥害事件這些線索，通過氣相色譜法對產(chǎn)品進(jìn)行對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“齊二藥”的亮菌甲素注射液中含有30%的二甘醇，而大理藥業(yè)產(chǎn)品中未含有二甘醇，從而找出了事件發(fā)生的原因，為該事件的及時、有效處理提供了有力的技術(shù)支撐。筆者在此進(jìn)行總結(jié)研究，以為建立相關(guān)的應(yīng)急檢驗(yàn)方法提供參考。

1 儀器與材料

1.1 試藥

亮菌甲素注射液（齊二藥，批號：06030501，規(guī)格：5mg·10mL－1；大理藥業(yè)，批號：051202，規(guī)格5mg·10mL－1）；二甘醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：T20050928）；丙二醇（批號：940506，分析純）、聚山梨酯-80（批號：981201-3）、丙三醇（批號：20040803-1，分析純）均由廣州化學(xué)試劑廠提供；聚乙二醇400（遼陽華興藥用輔料廠，批號：20060223006）。

1.2 動物

NIH小鼠，SPF級，♀♂各半，18～28g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：2005A011，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（粵）2004-0050。

1.3 儀器

Agilent 6890N型氣相色譜儀（美國安捷倫公司）；HP6890GC/5973MS型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國惠普公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 亮菌甲素注射液毒性篩查實(shí)驗(yàn)

取NIH小鼠18只，♀♂各半，分為3組，每組6只小鼠，其中一組為齊二藥生產(chǎn)的亮菌甲素注射液組（簡稱齊二藥組），另一組為大理藥業(yè)生產(chǎn)的亮菌甲素注射液組（簡稱大理組），同時設(shè)0.9%氯化鈉注射液組為陰性對照組。各給藥組小鼠分別尾靜脈注射供試品原液每只0.5mL（相當(dāng)于人臨床用量的111倍，人臨床用藥按每60kg注射10mL計），注射速度為15s。觀察一次性給藥后小鼠外觀、行為及死亡情況，觀察期為7d，并對死亡小鼠進(jìn)行大體解剖，取肝、腎組織，以10%福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色，于OlympusBX41顯微鏡下進(jìn)行觀察。

結(jié)果，齊二藥組給藥后3～5min內(nèi)，6只小鼠均死亡，解剖死亡小鼠可見腎臟顏色較正常小鼠深，肝臟呈粒狀、針狀結(jié)節(jié)，病理組織學(xué)檢查可見小鼠肝細(xì)胞呈輕度脂肪變性，腎小管上皮細(xì)胞壞死明顯；大理組6只小鼠均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，小鼠解剖及肝、腎病理檢查未發(fā)現(xiàn)異常。提示同等劑量下，齊二藥產(chǎn)品毒性大于大理產(chǎn)品，且齊二藥產(chǎn)品毒性靶器官為肝、腎。小鼠腎臟、肝臟外觀分別見圖1、圖2，其病理切片分別見圖3、圖4。

圖1 2組小鼠腎臟外觀比較Fig 1 Comparison of the kidney appearance of mice

圖2 2組小鼠肝臟外觀比較Fig 2 Comparison of the liver appearance of mice

圖3 各組小鼠腎臟病理切片圖（HE×100）Fig 3Pathological section map of mice kidney（HE×100）

圖4 各組小鼠肝臟病理切片圖（HE×100）Fig 4Pathological section map of mice liver（HE×100）

2.2 亮菌甲素注射液半數(shù)致死量（LD50）測定[1]

取小鼠，按體重、性別隨機(jī)分成11組，每組10只，♀♂各半；各劑量間距根據(jù)受試物情況和預(yù)試結(jié)果，設(shè)定為0.8∶1，齊二藥組劑量分別為25.0、20.0、16.0、12.8、10.24mL·kg－1，大理組劑量分別為31.5、25.0、20.0、16.0、12.8mL·kg－1，樣品稀釋溶劑為0.9%氯化鈉注射液，各組小鼠分別靜脈注射各濃度的受試溶液，給藥體積為0.5mL·20g－1，注射速度為30s；同時設(shè)氯化鈉注射液對照組（陰性對照），給藥劑量為0.5mL·20g－1，觀察一次性給藥后小鼠外觀、行為及死亡情況，觀察期為14d，用Bliss統(tǒng)計學(xué)方法計算出LD50值。

結(jié)果，靜脈注射給予齊二藥亮菌甲素注射液，劑量為20.0、25.0mL·kg－1組部分小鼠出現(xiàn)抽搐、死亡或蜷伏，最快死亡時間在3min內(nèi)，小鼠死亡多發(fā)生在注射當(dāng)天和第2天；大理組在給藥31.5mL·kg－1后部分小鼠出現(xiàn)抽搐、死亡或蜷伏，最快死亡時間在10min內(nèi)，死亡多發(fā)生在注射后第2天。2組存活小鼠觀察前期活動減少、食欲降低、體重減輕，觀察后期逐步恢復(fù)正常；氯化鈉注射液對照組小鼠未見異常及死亡。

采用新藥統(tǒng)計軟件（NDST，5.1版本），用Bliss法計算LD50及95%的可信限。在等給藥體積、不等給藥濃度情況下，齊二藥組LD50為17.72mL·kg－1，其95%的可信限是15.06～20.92mL·kg－1；而大理組的LD50為21.06mL·kg－1，其95%的可信限是19.0～23.46mL·kg－1，結(jié)果詳見表1。

表1 2個廠家亮菌甲素注射液小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of acute toxicity test of Armillarisin A injection produced by 2companies

2.3 亮菌甲素注射液輔料毒性篩查實(shí)驗(yàn)

亮菌甲素注射液的處方中含聚乙二醇40015g，聚乙二醇400質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2]顯示其含有雜質(zhì)二甘醇，毒性可能較大。筆者在實(shí)驗(yàn)中設(shè)定了缺主藥亮菌甲素外的其他配方成分組和聚乙二醇400高、低劑量組共3個實(shí)驗(yàn)組。取小鼠，按體重隨機(jī)分為3組，每組5只，第1組按照亮菌甲素注射液處方量[3]，在實(shí)驗(yàn)室制備出缺主藥亮菌甲素外的溶液（配方為丙二醇（15g）、聚乙二醇400（10g）、聚山梨酯-80（1g）、水（少量），水浴加熱煮沸10min，加入已溶解的硫脲，加水至50mL，用枸櫞酸調(diào)pH 4.2～5.2，即得）；第2組為聚乙二醇400組（原液組）；第3組為聚乙二醇400稀釋液組（1∶5）（取聚乙二醇400用注射用水進(jìn)行稀釋）。每只小鼠分別尾靜脈注射上述受試溶液0.8mL，觀察一次性給藥后小鼠外觀、行為及死亡情況，觀察期為7d。

結(jié)果，3組小鼠均存活，表現(xiàn)正常，未發(fā)現(xiàn)輔料有直接毒性反應(yīng)，基本排除了正常輔料本身可能產(chǎn)生的異常毒性作用。

2.4 毒性物質(zhì)篩查試驗(yàn)

在完成用小鼠進(jìn)行毒性篩查實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)其輔料之一聚乙二醇400在質(zhì)量控制中需要對二甘醇和乙二醇含量進(jìn)行控制的要求，以及二甘醇在歷史上多次發(fā)生藥害事件這些線索，用氣相色譜法測定亮菌甲素注射液中二甘醇含量及采用氣-質(zhì)聯(lián)用色譜定性檢測二甘醇。

2.4.1 采用氣相色譜法[4]定量測定二甘醇含量。以丙三醇為內(nèi)標(biāo)，制備對照品溶液。精密稱取二甘醇對照品0.05381g，加內(nèi)標(biāo)溶液（取丙三醇適量，精密稱定，1.0049g，加水溶解并稀釋至2000mL，搖勻，即得）溶解，并用內(nèi)標(biāo)稀釋成每1mL中含53.81、107.62、215.24、322.86、430.48、538.10μg二甘醇的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液（精密量取批號為06030501樣品2.0mL，置于20mL容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；再取2.0mL置于200mL容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液溶解稀釋至刻度，搖勻，即得）。同時取大理藥業(yè)生產(chǎn)亮菌甲素注射液（批號為051202）同法處理進(jìn)行測定。

精密量取對照品溶液和供試品溶液各0.2μL注入氣相色譜儀。色譜條件：聚乙二醇彈性石英毛細(xì)管柱（柱長15m，內(nèi)徑0.53mm，膜厚1.0μm），程序升溫：初始溫度為140℃，保持1min；以每分鐘8℃的速度升至220℃，保持5min。進(jìn)樣口溫度為220℃，檢測器溫度為250℃，不分流進(jìn)樣，載氣為氮?dú)猓瑝毫?.2psi。記錄色譜圖，測定供試品中二甘醇的含量[5]。色譜見圖5。

圖5 亮菌甲素注射液氣相色譜圖A.二甘醇對照品；B.齊二藥亮菌甲素注射液；C.大理藥業(yè)亮菌甲素注射液Fig 5 GC chromatogram ofArmillarisinAinjection A.diethylene-glycol control；B.Armillarisin A injection produced by Qiqihar Second Pharmaceutical Company；C.Armillarisin A injection produced by Dali Pharmaceutical Limited Company

由圖5可見，保留時間約為6.3min者為二甘醇峰，約為10.2min者為丙三醇峰。結(jié)果顯示，齊二藥亮菌甲素注射液中含有二甘醇，含量為292.8mg·mL－1；大理藥業(yè)亮菌甲素注射液中不含二甘醇。

2.4.2 采用氣-質(zhì)聯(lián)用色譜定性檢測二甘醇。制備對照品溶液（精密稱取二甘醇對照品20.4mg，加甲醇適量使溶解，并再加甲醇稀釋至50mL）和供試品溶液（精密量取齊二藥亮菌甲素注射液5mL，加甲醇稀釋至濃度為原液1%的溶液）。分別精密量取2種溶液各1.0μL注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。氣相色譜條件：毛細(xì)管色譜柱 OV-1（15m×0.2mm×0.25μm），柱溫：初始溫度為80℃，以每分鐘10℃的速度升至260℃；進(jìn)樣口溫度：250℃，柱前壓：55KPa，連接線溫度：280℃，分流比：1/30。質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度：230℃，掃描范圍：29～400amu，電子倍增器：1400V。

通過對亮菌甲素注射液中“二甘醇”進(jìn)行確證，結(jié)果證實(shí)齊二藥亮菌甲素注射液多出的峰為二甘醇的峰。

3 討論

齊二藥亮菌甲素注射液的LD50是17.72mL·kg－1，大理產(chǎn)品的LD50是21.06mL·kg－1，2個廠家的產(chǎn)品毒性相差3.34mL·kg－1；病理檢查結(jié)果顯示，齊二藥的亮菌甲素注射液致死小鼠的肝細(xì)胞呈輕度脂肪變性，腎小管上皮細(xì)胞壞死明顯，而大理藥業(yè)組小鼠未發(fā)現(xiàn)肝、腎有異常現(xiàn)象，提示齊二藥亮菌甲素注射液毒性大于大理藥業(yè)的亮菌甲素注射液。

氣相色譜測定結(jié)果表明，齊二藥亮菌甲素注射液每1mL中含292.8mg二甘醇，基于2個樣品中除了齊二藥亮菌甲素注射液含有二甘醇外，其他基本相同的結(jié)果，可以認(rèn)為齊二藥亮菌甲素注射液毒性增大是其中所含二甘醇引起的。

本研究通過小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)，快速比較出齊二藥產(chǎn)品的毒性比大理藥業(yè)產(chǎn)品毒性大，這樣在應(yīng)急檢驗(yàn)中使研究者將目光集中在藥品質(zhì)量上來，排除了對其他可能引起藥害的原因的懷疑，可見利用動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行毒性篩查在藥品質(zhì)量應(yīng)急檢驗(yàn)中有著非常重要的作用，其可以在較短時間內(nèi)提供毒性程度、靶器官，以及整體毒性情況，可為下一步的藥品質(zhì)量分析指明方向，是應(yīng)急檢驗(yàn)中的重要組成部分。

分析中，筆者根據(jù)事件發(fā)生醫(yī)院此前長期使用大理藥業(yè)同品種產(chǎn)品未出現(xiàn)類似問題，而此次是該院第1次使用齊二藥產(chǎn)品的事實(shí)，從而產(chǎn)生了尋找參照物進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)研究的思路。故在研究中對不同廠家生產(chǎn)的亮菌甲素注射液進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，并在短時間內(nèi)比較出同品種不同廠家樣品的差異，因此，同品種比對分析是該次應(yīng)急檢驗(yàn)取得成功的關(guān)鍵因素之一。

藥品質(zhì)量應(yīng)急檢驗(yàn)在我國是一個全新的課題，急需建立相應(yīng)質(zhì)量排查方法。此文報道的對齊二藥亮菌甲素注射液毒性物質(zhì)進(jìn)行篩查的研究，是藥品質(zhì)量應(yīng)急排查的一個成功案例，其經(jīng)驗(yàn)值得推廣應(yīng)用。

[1] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則[S].2005.

[2] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：916、附錄30、31.

[3] 國家藥品監(jiān)督管理局.亮菌甲素注射液國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].2002.

[4] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項目批準(zhǔn)件[S].2006.

Screening of Toxic Substance from Armillarisin A Injection in“Qieryao”Adverse Drug Events

LI Jin-fei，LIANG Qi，LI Yang（Guangdong Institute for Drug Control，Guangzhou 510180，China）

OBJECTIVE：To detect the toxic substance from Armillarisin A injection in“Qieryao”adverse drug events，and to find out the cause and establish emergency laboratory method.METHODS：Mice acute toxicity test was conducted to compare the toxicity （LD50）between Armillarisin A injection produced by Qiqihar Second Pharmaceutical Company and Dali Pharmaceutical Limited Company.The toxicity of PEG400in Armillarisin A injection was determined to confirm whether general excipients contained toxic substance.The contents of diethylene-glycol in Armillarisin A injection from 2companies were determined by GC；the diethylene-glycol component of Armillarisin A injection produced by Qiqihar Second Pharmaceutical Company was confirmed by GC-MS spectrometry.RESULTS：The LD50of Armillarisin A injection from 2companies were 17.72mL·kg－1and 21.06mL·kg－1；the content of diethylene-glycol was 293mg·mL－1in Armillarisin A injection produced by Qiqihar Second Pharmaceutical Company while hadn’t been detected in the other one.Mice used PEG400survived and grew normally.GC-MS spectrometry confirmed that Armillarisin A injection produced by Qiqihar Second Pharmaceutical Company contained diethylene-glycol.CONCLUSION：It has been confirmed that the increasing toxicity of Armillarisin A injection produced by Qiqihar second pharmaceutical company is induced by diethylene-glycol.The screening of toxic substance by animal experiment can be used for emergency laboratory method.

“Qieryao”events；Armillarisin A injection；Toxic substance；Diethylene-glycol；Emergency laboratory method

Δ廣東省科技廳2008年資助項目（2008A060202003）

＊主任藥師，碩士。研究方向：藥品檢驗(yàn)、藥品安全性評價。電話：020-81886208。E-mail：jinfeii@hotmail.com

2010-04-20

2010-08-16）