喻 東，蘇 建，高 陪，沈 競(jìng)，孫啟玲

四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610064

利用大豆乳清廢水生產(chǎn)SCP的研究

喻 東，蘇 建，高 陪，沈 競(jìng)，孫啟玲*

四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610064

以大豆乳清廢水為原料，通過(guò)對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母的培養(yǎng)，使大豆乳清廢水中的營(yíng)養(yǎng)成分被酵母菌吸收利用，從而使菌體生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生單細(xì)胞蛋白。單細(xì)胞蛋白(SCP)產(chǎn)量為8.7 mg/mL，蛋白含量為51.3%;且廢水COD去除率達(dá)到73.4%，達(dá)到了國(guó)家乳清廢水的標(biāo)準(zhǔn)，從而實(shí)現(xiàn)了廢水資源化利用的目的。

大豆乳清廢水;酵母菌;單細(xì)胞蛋白;蛋白含量

由于目前國(guó)際市場(chǎng)魚(yú)粉價(jià)格的不斷上漲，對(duì)國(guó)內(nèi)飼料工業(yè)及畜牧業(yè)有著較大的沖擊。魚(yú)粉作為優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白飼料，粗蛋白質(zhì)含量一般在45%以上，高的可達(dá)60%以上。它的作用是構(gòu)成動(dòng)物體各種組織，維持正常代謝、生長(zhǎng)、繁殖和生產(chǎn)各種產(chǎn)品所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因而，尋找廉價(jià)的替代品就成為解決目前國(guó)內(nèi)飼料工業(yè)及畜牧業(yè)困境的一條重要途徑。

酵母菌具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快等特點(diǎn)，其細(xì)胞內(nèi)含豐富蛋白質(zhì)、脂肪和核酸等物質(zhì)，宜于工業(yè)化生產(chǎn)開(kāi)發(fā)，是生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的常用菌種，所生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白是良好的動(dòng)物飼料。由于酵母菌的生長(zhǎng)對(duì)培養(yǎng)條件要求較低，產(chǎn)量較高。另外，隨著大豆蛋白加工行業(yè)的快速發(fā)展，其生產(chǎn)過(guò)程排放的高濃度有機(jī)廢水水量也在增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每加工1 t大豆將排放2～5 t乳清廢水，廢水中可生物降解的有機(jī)物質(zhì)量濃度(生物耗氧量，BOD)在8000 mg/L以上［1-2］。另外，大豆乳清廢水含有大量的蛋白質(zhì)、低聚糖等天然有機(jī)物，是生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白(SCP)的良好原料。利用大豆蛋白生產(chǎn)工藝排出的高濃度乳清廢水進(jìn)行SCP生產(chǎn)，在回收SCP產(chǎn)生良好經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，可大幅度削減大豆乳清廢水的COD質(zhì)量濃度，降低后續(xù)廢水的處理費(fèi)用以及甲烷和CO2的排放量。因此，可用它來(lái)處理豆制品生產(chǎn)廢水，并可獲得單細(xì)胞菌體蛋白，這樣不僅使廢棄物得到利用，還能解決環(huán)境污染問(wèn)題，對(duì)中小豆制品加工生產(chǎn)企業(yè)具有一定的實(shí)際價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大豆乳清廢水

大豆乳清廢水取自當(dāng)?shù)啬炒蠖沟鞍咨a(chǎn)企業(yè)，其水質(zhì)分析結(jié)果如表1所示。該廢水COD質(zhì)量濃度高達(dá)12236 mg/L，可生化系數(shù)(COD/BOD5，簡(jiǎn)寫(xiě)為B/C)大于0.6，是微生物生長(zhǎng)的良好底料。廢水的pH值偏酸性，水溫適中，氮素營(yíng)養(yǎng)充分，可滿足酵母菌增殖過(guò)程對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)的需求。

1.1.2 酵母菌種的篩選與來(lái)源

以大豆乳清廢水為培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的酵母菌種進(jìn)行了篩選，包括白地霉(Geotrichum candidum Link)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、熱帶假絲酵母(Candida tropica Lis)、解脂假絲酵母(Candida lipolytica var.Lipolytica)、扣囊復(fù)膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、微球酵母(Lievitopalla adessere volatili)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和生香酵母。白地霉水解蛋白能力強(qiáng)，環(huán)境適應(yīng)能力好;產(chǎn)朊假絲酵母可以利用紙漿、蜜糖、土豆淀粉廢料和木材水解液，除了可以有效利用各種單糖和低聚糖之外，還可以分解纖維素一類(lèi)的大分子物質(zhì);熱帶假絲酵母降解轉(zhuǎn)化玉米粉和烴類(lèi)有機(jī)物較強(qiáng)，可利用各種糖類(lèi)滿足自身生長(zhǎng)的需要;解脂假絲酵母分解脂肪和蛋白質(zhì)的能力都很強(qiáng);扣囊復(fù)膜孢酵母能有效地利用淀粉和蛋白質(zhì)作為能源和氮源，同時(shí)還具有降解轉(zhuǎn)化其他多種天然有機(jī)物的能力［3，4］。

表1 大豆乳清廢水水質(zhì)Table 1 The composition of soybean whey wastewater

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

菌種活化:挑取保藏于冰箱中的斜面菌種，接種于YEPG斜面培養(yǎng)基(2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母膏，2%瓊脂)上，在隔水式培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)36 h活化;傳代，備用。

種子培養(yǎng):從YEPG培養(yǎng)基上挑取酵母單菌落，接種于YEPG液體培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，繪制其生長(zhǎng)曲線，確定種子培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.2 SCP生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 種子培養(yǎng)

將通過(guò)種子培養(yǎng)獲得的種子液，在3000 r/min離心10 min，收獲的菌體用生理鹽水洗滌1次后，以生理鹽水稀釋，制備成一定濃度的菌懸液，備用。

1.2.2.2 SCP培養(yǎng)

取自然澄清的大豆乳清廢水(未經(jīng)滅菌處理) 100 mL置于500 mL搖瓶中，調(diào)節(jié) pH值分別為4.0、5.0、6.0和7.0;接種菌懸液，用富氧膜封口;在搖床中于28℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.2.3 檢測(cè)方法

生物量:離心收集菌體，105℃烘干;蛋白含量:凱氏定氮法;

2 結(jié)果與分析

2.1 適合乳清廢水菌株的篩選

表2 不同酵母菌發(fā)酵50 ml廢水的總蛋白產(chǎn)量Table 2 The protein production of 50 ml wastewater on the different yeast fermentation

從表2可知，菌體自身蛋白含量較高的為產(chǎn)朊假絲酵母和熱帶假絲酵母，分別為 51.8%和50.4%，綜合其總蛋白產(chǎn)量，發(fā)酵50 mL廢水產(chǎn)朊假絲酵母最高可達(dá)249.9 mg，也即5.0 g蛋白/L廢水。因此，從應(yīng)用飼料的角度考慮，將產(chǎn)朊假絲酵母作為發(fā)酵廢水的菌株。

2.2 產(chǎn)朊假絲酵母種子生長(zhǎng)曲線

圖1 產(chǎn)朊假絲酵母菌株在YEPG培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of Candida utilis in the YEPG

從圖1可以看出，產(chǎn)朊假絲酵母菌株在培養(yǎng)到第16 h菌體量達(dá)到最大為12.13 mg/mL，而在14 h菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中后期，菌體量已達(dá)11.83 mg/mL，因此為保證菌體生長(zhǎng)活力及接種量，種子培養(yǎng)14 h為最佳。

2.3 廢水初始pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

用乳酸將廢水的pH值分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0，接種后搖瓶培養(yǎng)24 h，并每隔4 h取樣測(cè)培養(yǎng)液中的菌體量及pH值，以考察pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.2 The effect of biomass growth on the different initial pH

由圖2可知，除pH4.0在20 h菌體量達(dá)到最大外，其余各個(gè)pH條件下菌體量均在16 h達(dá)到最大值，其中pH5.0和pH6.0較高，分別為10.03 mg/ mL和9.98 mg/mL，pH4.0和pH7.0的菌體量稍低，分別為9.44 mg/mL和9.47 mg/mL;在pH7.0條件下，由于pH較高致使菌體生長(zhǎng)過(guò)快的進(jìn)入衰亡期，導(dǎo)致細(xì)胞破裂蛋白降低，pH繼續(xù)升高(見(jiàn)圖2和圖3)又將進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞衰亡，不利于單細(xì)胞蛋白的產(chǎn)量;另外，在pH4.0條件下，菌體生長(zhǎng)偏慢，得到的菌體蛋白也不及pH5.0和pH6.0;因此，在利用酵母菌對(duì)用豆制品生產(chǎn)廢水進(jìn)行處理時(shí)，廢水初始pH值應(yīng)控制為5.0～6.0較適宜，此條件下可以較快獲得大量的酵母菌細(xì)胞。

由圖3可知，隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，發(fā)酵環(huán)境的pH值均是先降低后升高的。這是由于菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期主要進(jìn)行三羧酸循環(huán)途徑，產(chǎn)生的大量CO2溶于水中造成。但當(dāng)酵母菌進(jìn)入穩(wěn)定期后，一方由于菌體破裂釋放出一部分氨基類(lèi)物質(zhì)，從而造成廢水pH升高;另一方面，大量具體需要合成更多的蛋白質(zhì)。圖4表明不同pH的初始條件對(duì)菌體合成蛋白也有一定影響，初始pH5.0時(shí)菌體蛋白含量最高為51.3%。酵母菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程，吸收銨鹽同化氨態(tài)氮的途徑有限，其中最常見(jiàn)的有兩個(gè)，即谷氨酸脫氫酶(GDH)途徑和谷氨酰胺合成酶(glns)-谷氨酸合成酶(glus)途徑［5，6］。在氨質(zhì)量濃度高時(shí)，主要通過(guò)GDH途徑同化氨:

在氨質(zhì)量濃度較低時(shí)，則主要通過(guò)glns-glus途徑同化。在此途徑中，氨首先與谷氨酸結(jié)合，生成谷氨酰胺，然后谷氨酰胺的酰胺氮被轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸上，產(chǎn)生2個(gè)谷氨酸:

谷氨酸+NH3+ATP→谷氨酰胺+ADP+Pi;

α-酮戊二酸+谷氨酰胺+NADPH+H+→2谷氨酸+NADP+;

由此可見(jiàn)，上述2種谷氨酸的合成途徑中，均需消耗H+，H+濃度的不斷降低，會(huì)直接導(dǎo)致了系統(tǒng)pH值的升高。pH的升高，在酵母開(kāi)放的發(fā)酵過(guò)程中，不利于抑制細(xì)菌的生長(zhǎng);另外，從上述兩條同化氨化氮，也可以看出保持系統(tǒng)充足的H+濃度，有利于酵母菌同化氨化氮進(jìn)而促進(jìn)其生長(zhǎng)。因此在酵母發(fā)酵過(guò)程中保持pH值在5.0～6.0之間是很有必要的。

2.4 接種量對(duì)酵母菌培養(yǎng)的影響

酵母菌按1%、5%、10%和15%的比例分別接種于廢水，搖瓶培養(yǎng)24 h后測(cè)定培養(yǎng)液中的菌體量、菌體蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

從圖5可知，隨著接種量的增加，酵母菌在培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)液中菌體量也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。但當(dāng)接種量超過(guò)5%以后，但其SCP產(chǎn)量變化差異不大，產(chǎn)量在10 mg/mL左右。因此，從放大及成本考慮接種時(shí)應(yīng)將接種量控制在5%。另外，圖6可以看出接種量對(duì)SCP蛋白含量的影響并不明顯，其蛋白含量均控制在51.1%～51.5%之間。

2.5 最佳條件的確定

通過(guò)2.3中對(duì)發(fā)酵廢水pH以及2.4中接種量的單因素調(diào)控，得出廢水發(fā)酵pH維持在5.0(發(fā)酵過(guò)程中每隔2 h進(jìn)行pH測(cè)定，通過(guò)滴加乳酸調(diào)節(jié)系統(tǒng)pH)，接種量5%，溫度28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。結(jié)果測(cè)得SCP產(chǎn)量8.7%，蛋白含量為51.3%。

2.6 酵母發(fā)酵生產(chǎn)SCP后對(duì)COD的影響

表4 酵母發(fā)酵生產(chǎn)SCP后COD去除率Table 4 The COD removal rate of the wastewater after fermentation

從表3可以看出，通過(guò)利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)SCP，可將廢水的COD降低至26.6%，使其73.4%的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化到菌體當(dāng)中，創(chuàng)造大量的菌體蛋白。在改善環(huán)境的同時(shí)也帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

3 結(jié)論與展望

本研究從目前市場(chǎng)亟待解決的問(wèn)題出發(fā)，立足于解決飼料工業(yè)及畜牧業(yè)中高價(jià)魚(yú)粉的替代品。在選育高產(chǎn)量菌體蛋白的酵母菌的同時(shí)，立足于現(xiàn)有資源，將大豆行業(yè)的乳清廢水利用到單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)當(dāng)中，變廢為寶使資源得到充分利用。

本研究不僅可凈化大豆乳清廢水，而且還從中獲取了10 kg/m3廢水的優(yōu)質(zhì)飼料(單細(xì)胞蛋白)，其蛋白含量為51.3%，高于普通魚(yú)粉。使廢水的COD由原來(lái)的12236 mg/L，降低了73%，使COD中的8932 mg/L的物質(zhì)得到了再利用，大大的降低了碳氮的排放。另外，廢水處理速度與生產(chǎn)同步，當(dāng)天產(chǎn)生的廢水可以即時(shí)處理，不需投資更多的貯存設(shè)施。

本研究工藝與生產(chǎn)實(shí)際基本一致，因此，放大不存在較大困難。另外，本研究從大豆行業(yè)的乳清廢水出發(fā)，獲得單細(xì)胞蛋白，對(duì)其他類(lèi)似行業(yè)也有相應(yīng)啟發(fā)作用，例如果汁行業(yè)的果渣，制糖行業(yè)的甘蔗渣，釀酒行業(yè)的酒糟等，都可以作為生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的優(yōu)質(zhì)原料。簡(jiǎn)言之，此研究工藝是一個(gè)在生產(chǎn)廠家很值得推廣的項(xiàng)目。

1 Zhang P(張平)，Li JZ(李建政)，Lin ZH(林芝紅)，et al.Screening of yeasts for single-cell-protein production by soybean whey fermentation.J Harbin Univ Comm，Nat Sci(哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)2008，24:204-206.

2 Shao W(邵偉)，Wu YJ(吳鈺潔)，Xiong Z(熊澤)，et al.Study on the yeast SCP production by using of wastewater from production of soybean product.Food Sci Technol(食品科技)2005，10:98-100.

3 Wei Q(魏群)，Sun YM(孫玉梅)，Li GT(李廣通).Cultivation of lipid yeast by using of wasterwater from production of soybean product.China Brewing(中國(guó)釀造)，2005，5:37-39.

4Zhang J(張繼)，Wu GP(武光朋)，Wang WQ(王文強(qiáng))，et al.Research development of the production of single cell protein feed.Feed Ind(飼料工業(yè))，2006，50-52.

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6 Smirnova IE.Mixed cultures of cellulolytic bacteria and yeasts for preparation of feed protein based on plant waste material.VestnS-khNaukiKaz(Russian)，2000(6):62-63.

SCP Production from Soybean Whey

YU Dong，SU Jian，GAO Pei，SHEN Jing，SUN Qi-ling*
College of Life Sciences，Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment of Ministry of Education，Sichuan University，Chengdu 610064，China

The Candida utilis were used for single-cell protein(SCP)production from soybean whey by batch fermentation.As the result，SCP was yielded of 8.7 mg/mL with 51.3%protein，and the wastewater COD removal rate reached 73.4%.After that，soybean whey reached the national standard and achieved the purpose of water resource utilization.

soybean whey;Candida utilis;single-cell protein;protein content

1001-6880(2011)03-0538-04

2010-01-11 接受日期:2010-05-12

*通訊作者 E-mail:qlsun@126.com

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