陳霞，黃玉軍，王琴，任遠慶，顧瑞霞，*

（1.揚州大學江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州 225127；2.克拉瑪依農(nóng)牧科學研究所，新疆 克拉瑪依 834000）

熱處理條件對牛乳中耐熱芽孢致死效果的影響

陳霞1，黃玉軍1，王琴2，任遠慶2，顧瑞霞1，*

（1.揚州大學江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州 225127；2.克拉瑪依農(nóng)牧科學研究所，新疆 克拉瑪依 834000）

耐熱芽孢是引起超高溫滅菌乳質(zhì)量問題的最重要的一類微生物，本研究從不同來源的原料乳中分離并鑒定得到24株耐熱芽孢桿菌，經(jīng)生長特性比較，發(fā)現(xiàn)它們的最適生長溫度在37℃～42℃之間，并分屬5種不同類型；經(jīng)121℃/10 min和135℃/4 s熱處理后，熱致死率在58.08%～71.43%之間；經(jīng)不同熱處理方法比較發(fā)現(xiàn)，耐熱芽孢經(jīng)85℃/15 s熱處理后，37℃保溫2 h，再經(jīng)過135℃/4 s處理，熱致死率超過99.99%。

芽孢桿菌；熱處理；致死率

芽孢桿菌屬（Bacillus）是一類好氧或兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子的桿狀細菌[1]。由于能夠產(chǎn)生對熱、紫外線、電磁輻射和某些化學物質(zhì)有很強抗性的芽孢，可耐受各種不良環(huán)境，如可以在pH為2.0～3.0的環(huán)境中生存，可以在溫度高達80℃甚至以上的條件下生長，南極寒冷的冰雪中也能見到他們的蹤跡[2]。

乳中芽孢桿菌（spore-forming bacillus）因能形成耐熱性芽孢，故殺菌處理后，仍殘存在乳中，這些芽孢都會不同程度的引起乳及乳制品的變質(zhì)。芽孢桿菌屬可以使鮮乳、酸奶中的蛋白質(zhì)、脂肪分解，相應的會有蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的腐敗味、脂肪分解產(chǎn)生的酸敗味，并導致原料乳產(chǎn)氣，產(chǎn)酸而變黏稠[3]。

我國幅員遼闊，奶牛飼養(yǎng)條件和管理水平差異很大，導致原料乳質(zhì)量參差不齊，每年因耐熱芽孢滅菌不徹底導致超高溫滅菌（UHT）乳等乳產(chǎn)品質(zhì)量事故損失巨大。因此，有必要對耐熱芽孢生長特性及熱致死特性進行研究，以便針對不同原料乳特點采用合適的生產(chǎn)工藝條件，降低因耐熱芽孢滅菌不徹底而導致產(chǎn)品質(zhì)量事故引起的損失。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

原料乳：從江蘇不同地區(qū)牧場收集，其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。用于芽孢桿菌分離與培養(yǎng)的脫脂乳培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液、T2培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)液均參考相關(guān)文獻[2]配制，發(fā)酵液體培養(yǎng)基成分參考相關(guān)文獻[3]配制。

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；SPX-150BS-II生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療機械有限公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺：蘇州凈化設備廠；755S型紫外可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；pHS-3C型精密pH計：上海雷磁儀器廠；XSP-8CA生物顯微鏡：上海永亨光學儀器制造有限公司；SX－500高壓滅菌鍋：日本TOMY公司等。

1.2 方法

1.2.1 耐熱芽孢的分離

將新鮮原料乳加熱到100℃，保溫10 min，冷卻到46℃，用滅菌移液管吸取0.1 mL樣品于滅菌培養(yǎng)皿中，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使之混勻，待凝固后，翻轉(zhuǎn)板置于（42±1）℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h～72 h。挑取單個菌落并進一步分離純化，并在4℃冰箱中冷藏保藏[4]。

1.2.2 耐熱芽孢的鑒定

對分離出的耐熱芽孢先進行革蘭氏染色和耐熱芽孢鏡檢[5]，然后進行糖發(fā)酵試驗、VP試驗、淀粉水解試驗、吲哚試驗等生理生化試驗[6]，對分離出的耐熱芽孢菌進行鑒定。

1.2.3 耐熱芽孢總數(shù)的測定

用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒平板于（42±1）℃培養(yǎng)48 h～72 h后計數(shù)。

1.2.4 耐熱芽孢生長曲線測定[7]

用紫外分光光度計測定培養(yǎng)物的OD540值。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐熱芽孢的分離、鑒定與生長發(fā)育特性分析

從江蘇不同規(guī)模的8個牧場共計取12個奶樣，經(jīng)分離并鑒定獲得24株耐熱芽孢。將分離獲得的24株芽孢菌的生長特性進行比較，他們的最適生長溫度介于37℃～42℃之間。其中5株最適生長溫度為37℃，19株最適生長溫度為42℃。對生長曲線進行測定發(fā)現(xiàn)，24株耐熱芽孢歸于5種不同狀況，如圖1所示。

從圖1可以看出，5種芽孢桿菌均在0 h～8 h處于延緩期；YN12在8 h～40 h處于對數(shù)期，40 h～48 h處于穩(wěn)定期，48 h后進入衰亡期；YN15在8 h～32 h處于對數(shù)期，32 h～48 h處于穩(wěn)定期，48 h后進入衰亡期；YN23在8 h～40 h處于對數(shù)期，40 h后經(jīng)過短暫的穩(wěn)定期進入衰亡期；YN22在8 h～40 h處于對數(shù)期，40 h～48 h處于穩(wěn)定期，48 h后進入衰亡期；YN32在8 h～32 h處于對數(shù)期，32 h～40 h處于穩(wěn)定期，之后進入衰亡期。

2.2 不同芽孢的耐熱特性比較

對24株耐熱芽孢分別經(jīng)85℃/15 s、121℃/10 min和135℃/4 s熱處理后的熱致死率見表1。

由表1可以看出，85℃/15 s的熱處理對菌體的致死率在0.38%～3.93%之間，說明85℃/15 s的熱處理對耐熱芽孢的致死率效果很差；121℃/10 min熱處理對耐熱芽孢的致死率在58.08%～70.80%之間；135℃/4 s熱處理對耐熱芽孢的致死率在60.47%～71.43%之間。

2.3 不同熱處理方法對芽孢致死率的影響

對5株耐熱芽孢桿菌先采用85℃/15 s熱處理后，然后在4、8、37和42℃4種溫度條件下保溫不同的時間后，再經(jīng)135℃/4 s滅菌處理，各處理后的致死率如表2。

由表2可以看出，含耐熱芽孢的原料乳先進行85 ℃/15 s殺菌，然后置于4、8、37和42℃4種溫度條件下進行激活，再對其進行135℃/4 s滅菌處理后，耐熱芽孢桿菌致死率明顯提高，尤其是經(jīng)過37℃和42℃培養(yǎng)處理的芽孢桿菌，再經(jīng)過135℃/4 s熱處理后熱致死率明顯高于4℃和8℃。其中原料乳經(jīng)85℃/15 s處理，于37℃保溫2 h，再經(jīng)135℃/4 s的熱處理后，耐熱芽孢菌的致死率超過99.99%以上。

3 結(jié)論

本實驗從江蘇不同規(guī)模牧場的12個奶樣中共分離得到24株芽孢桿菌，經(jīng)生長特性比較發(fā)現(xiàn)，分屬5種不同生長類型，且這5種不同類型耐熱芽孢的耐熱特性亦有所區(qū)別。不同耐熱芽孢經(jīng)121℃/10 min及135℃/4 s熱處理后的熱致死率在58.08%～71.43%之間。進一步研究發(fā)現(xiàn)，將含耐熱芽孢的原料乳先經(jīng)85℃/15 s殺菌后，再采用37℃培養(yǎng)2 h后，經(jīng)135℃/4 s熱處理，熱致死率均超過99.9%?？赡苁且驗檠挎邨U菌在最適生長溫度下（37℃）更有利于出芽繁殖，因此再經(jīng)滅菌處理大大提高其致死率。

表 2 對5株芽孢桿菌進行不同熱處理后的致死率Table 2 The death rate of five heat-resistant bacillus after different heat treatment %

[1]韓永霞.牛乳中芽孢桿菌的動態(tài)變化及部分生物學特性的研究[D].內(nèi)蒙古:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學,2006(5):6-8.

[2]R.E.布坎南,N.E.吉本斯等.伯杰細菌鑒定手冊[M].科學出版社,1984:729-730

[3]葉鴻劍,王鑫,周銀貞.乳中芽孢桿菌對乳制品的危害及其檢測方法的研究[J].科技資訊,2006(17):150

[4]劉瑩,孫容丹,楊翔華，等.5株芽孢桿菌的分離鑒定、拮抗性試驗與抑菌效價測定[J].中國農(nóng)學通報,2006(5):32

[5]周德慶.微生物學教程[M].北京:北京教育出版社,1996:198-200.

[6]張剛.乳酸細菌—基礎、技術(shù)和應用[M].北京:化學工業(yè)出版社,2007:2-20

[7]梁俊芳,靳燁.原奶中芽孢桿菌生長曲線的分析研究[J].中國乳業(yè),2008(5):56

Influence of Different Heat-treatment Conditions on the Lethal Effect of Heat-resistant Spores in Milk

CHEN Xia1，HUANG Yu－jun1，WANG Qin2，REN Yuan－qin2，GU Rui－xia1，*
（1.Jiangsu Key Laboratories of Dairy Biological Technology and Safety Control，Yangzhou University，Yangzhou 225127，Jiangsu，China；2.Institute of Agriculture and Farming Science and Technology of Kelamayi；Kelamayi 834000，Xinjiang，China）

Heat－resistant spores is one of the most important microorganisms causing the quality problems of UHT milk.In this paper，24 heat－resistant bacillus were isolated and identified from different raw milk.Through the growth characteristics comparison，they could be divided into five different types and the most suitable growth temperature was between 37℃ and 42℃.After 121℃/10 min and 135℃/4 s heat treatment，heat death rate of heat－resistant bacillus was between 58.08%and 71.43%.Compared with the different heat treatment conditions，the bacillus treated under 85℃/15 s，incubated under 37℃/2 h，and then treated under 135 ℃/4 s，the heat death rate of bacillus was more than 99.99%.

bacillus；heat treatment；death rate

國家自然科學基金（30871815）；江蘇科技支撐計劃（BE2008357）

陳霞（1976—），女（漢），講師，博士研究生，研究方向：乳品科學。

*通信作者：顧瑞霞（1963—），男（漢），教授，博士，研究方向：乳品科學。

2011-12-29