傅升 呂紅兵 劉源 何黎升 樊麗娜 金巖

骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）家族成員都是通過結(jié)合兩種絲或蘇氨酸激酶受體（即 BMPsⅠ型、Ⅱ型受體）發(fā)揮作用的，Ⅰ型、Ⅱ型受體與配體結(jié)合形成異聚體，從而將BMPs信號傳遞給下游作用物[1-3]。目前已發(fā)現(xiàn)BMPs對靶細胞的生長、分化以及凋亡具有調(diào)控作用，此外還發(fā)現(xiàn)BMPs不僅與部分骨源性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，而且與部分涎腺腫瘤、胃癌以及前列腺癌等生物行為有關(guān)[4-6]，但對BMPs與鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚不清楚。

為分析和認(rèn)識BMPs與鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的可能關(guān)系，本研究將首次觀察BMPs在口腔鱗癌(舌癌細胞系Tca8113細胞)中的表達以及BMPⅡ突變受體基因轉(zhuǎn)染對口腔鱗癌生長的影響，這將有助于深入認(rèn)識口腔上皮惡變的機理，為今后應(yīng)用生物技術(shù)對口腔鱗癌進行有效治療提供實驗依據(jù)。

材料和方法

一、材料

Tca8113細胞由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院生物實驗室提供。FuGENE6 Transfection Reagent Kit、 DIG-DNA labelling and detection kit、BrdU 檢測試劑盒為 Boehringer Mannbeim公司產(chǎn)品。Pc-4質(zhì)粒為含有BMPsⅡ型突變受體cDNA（cDNA由日本KaWaSaKi醫(yī)學(xué)院分子生物所的Nohno教授提供）的真核表達載體。流式細胞儀：Coulter Epics Elite ESP。MTT為美國Sigma公司產(chǎn)品。Cyclin D1、p27單抗及CDK4、p57多抗購自美國Santa Cruz公司，LSAB增強性廣譜型免疫組化試劑盒購自丹麥 Dako公司。

二、方法

1.Tca8113細胞培養(yǎng)：用含10﹪胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5﹪CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，3 d換液1次，傳代3～4次使細胞達到良好的生長狀態(tài)。

2.BMPsⅡ型突變受體基因的轉(zhuǎn)染和鑒定：按試劑盒說明書進行操作和轉(zhuǎn)染后的鑒定。

3.原位雜交：按試劑盒說明書進行標(biāo)準(zhǔn)化的檢測。陰性對照用PBS代替探針，用Tca8113細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。

4.MTT 檢測：在96孔板上以4×103的密度接種前述兩組細胞。培養(yǎng)3 d后，每孔加入MTT(5 mg/ml )20μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸棄上清，加入 150μl DMSO 振蕩 15min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm的吸光度（A）值。

5.BrdU 檢測：實驗前1d接種前述兩組細胞到放有玻片的培養(yǎng)板中，每種細胞接種10個玻片。到實驗時細胞密度50﹪～80﹪。吸棄培養(yǎng)液，加入含0.01﹪BrdU的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1h，取出細胞爬片用抗-BrdU單抗檢測，計數(shù)陽性細胞。

6.流式細胞儀( flow cytometry,FCM)檢測：取細胞5×105，離心半徑10 cm,800 r/min，離心5min，棄上清，用PBS洗2次，70﹪乙醇固定，4℃過夜。上機前離心去除乙醇，PBS洗2次，加入溴化丙錠染液1ml，4℃閉光染色30min,上機檢測分析。

7.凋亡細胞的TUNEL法染色：細胞爬片經(jīng)Triton-100處理后，PBS振洗5min，共3次，平衡Buffer 1min，TdT酶37℃孵育1h后，中止Buffer 1min，BufferⅠ、BufferⅡ依次充分洗滌。2﹪正常羊血清封閉30min后，滴加抗標(biāo)記堿性磷酸酶地高辛抗體（1:150），37℃孵育2h后,BufferⅠ、BufferⅢ充分洗滌，NBT/BCIP暗處顯色2h，TE中止反應(yīng)，甲基綠復(fù)染，常規(guī)脫水透明封片。凋亡的陽性信號為位于細胞核中的藍黑著色。每個標(biāo)本均取不相重復(fù)的高倍視野，共計數(shù)500個細胞核，由此獲得凋亡指數(shù)（apoptosis index,AI）=凋亡細胞/所有記數(shù)細胞。

8.免疫組化檢測Tca8113、tBRII-Tca8113細胞中CyclinD1、CDK-4、p27和p57的表達和定量分析：按標(biāo)準(zhǔn)化的免疫組化方法進行染色，陰性對照用PBS代替一抗，其他同前。Cyclin D1與 CDK4 在細胞中的陽性信號均為覆蓋胞核、胞質(zhì)的棕黃色顆粒，p27和p57的陽性信號為胞漿著色。用免疫組化定量系統(tǒng)，對正常組和實驗組進行測量，每次測量前，都以統(tǒng)一的空白片作標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)整系統(tǒng)光度值，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)灰度，在同一灰度條件下，避開無細胞的區(qū)域，每張切片選擇5個不同的視野，用鼠標(biāo)按細胞的形態(tài)畫出細胞輪廓，自動測量，選平均灰度為測量指標(biāo)，放大倍數(shù)為400倍。系統(tǒng)設(shè)定白色最大灰度為256，黑色最小灰度為0。因此，灰度值越小，代表其陽性反映程度越高。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，加藥前后A值差異用配對t檢驗，tBRII-Tca8113和Tca8113兩組BrdU和灰度差異用比較采用獨立t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細胞克隆

轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)G-418篩選，2周后得到抗G-418的陽性細胞克隆，而未轉(zhuǎn)染細胞在含G-418的培養(yǎng)液中逐漸全部死亡，初步證明BMPsⅡ型突變受體基因的轉(zhuǎn)染成功（圖1）。

二、neo 基因的原位雜交

在轉(zhuǎn)染細胞的胞槳中有藍色顆粒樣陽性雜交信號(圖2)，進一步證明BMPsⅡ型突變受體基因的轉(zhuǎn)染Tca8113細胞成功，并有BMPsⅡ型突變受體mRNA的表達，未轉(zhuǎn)染細胞未見陽性信號。

三、MTT 檢測

轉(zhuǎn)染 BMPsⅡ型突變受體后，tBRII-Tca8113 細胞增殖活力變慢，與Tca8113細胞相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（見表1，圖3）。

四、BrdU 檢測

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 BMPsⅡ型突變受體后，與 Tca8113細胞（12.0±3.4）相比 ,tBRIITca8113細胞（23.0±1.9）DNA合成變慢，細胞增殖力下降，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.3013,P=0.000,表 2，圖 3）。

五、細胞周期分析

tBRII-Tca8113 細胞與Tca8113細胞相比，反應(yīng)細胞增殖活力的增殖指數(shù)PrI為9.1和14.7（見表3，圖3），結(jié)果與MTT檢測一致。

圖1 轉(zhuǎn)染后細胞克?。ǖ怪蔑@微鏡）（×100）

圖2 neo基因的原位雜交，提示在轉(zhuǎn)染的細胞中有藍色顆粒陽性雜交信號（×100）

圖3 MTT,BrdU,FCM分析結(jié)果

六、凋亡分析結(jié)果

轉(zhuǎn)染后tBRII-Tca8113細胞中的凋亡數(shù)目明顯增加，兩者之間的凋亡指數(shù)（3.7±1.2，8.7±1.6）比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.906，P=0.000，見圖 4)。

七、Cyclin D1、CDK4 、p27 和p57 表達的定量結(jié)果

Cyclin D1、CDK4 、p27和p57 的免疫組化染色結(jié)果（圖5～8）。用圖像分析系統(tǒng)對Cyclin D1、CDK4、p27和p57的表達進行平均灰度的測量，兩者之間各種細胞周期蛋白的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（見表4，圖9)。

表3 tBRII-Tca8113細胞與Tca8113細胞 FCM 分析結(jié)果

表4 CyclinD1、CDK4、p27、P57 的灰度測量值比較

圖4 轉(zhuǎn)染前后凋亡染色結(jié)果和凋亡的指數(shù)直方圖

圖5 CyclinD1免疫組化染色結(jié)果（免疫組化染色×100）

圖6 Tca8113細胞與 tBRII-Tca8113細胞Cyclin D1表達比較（免疫組化染色×100）

圖7 p27免疫組化染色結(jié)果（免疫組化染色×400）

圖8 p57免疫組化染色結(jié)果（免疫組化染色×400）

圖9 Cyclin D1、CDK4、p27和p57在Tca8113和tBRII-Tca8113細胞中的平均灰度測量值

討 論

Heikinheimo等[3]研究正常涎腺組織中 BMP-6 的表達發(fā)現(xiàn)，在成人頜下腺的腺泡細胞中有BMP-6 的低表達，而其他類型的細胞則無表達；BMP-6 在腮腺和頜下腺的漿液性腺泡細胞中有特異性免疫定位點。Yang等[7]于1993較早觀察并證實了 BMPs在涎腺多形性腺瘤中的表達，并認(rèn)為其表達可能與多形性腺瘤中的軟骨樣組織的形成有關(guān)。Harris等[8]發(fā)現(xiàn) BMP-6不僅在正常的前列腺中表達，而且在前列腺癌中出現(xiàn)高表達，認(rèn)為可能與前列腺組織具有異位成骨的能力有關(guān)。上述腫瘤性上皮細胞出現(xiàn)的 BMPs 表達，作者都認(rèn)為可能與這些腫瘤組織中的骨、軟骨樣組織形成有關(guān)。除此之外，BMPs是否參與了對上皮組織惡變的調(diào)控，這種調(diào)控是由于BMPs基因突變所至，還是由于其他因素導(dǎo)致 BMPs 信號表達水平的改變，目前尚未得出明確結(jié)論。本研究以 BMPsⅡ型突變受體基因為目的基因，以 Tca8113 細胞（人舌鱗癌細胞）為載體細胞，建立穩(wěn)定表達 BMPsⅡ型突變受體的 Tca8113 細胞，以便進一步從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平探討 BMPs 信號表達水平的改變和 BMPs 基因突變在口腔上皮組織惡變和口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

本研究中轉(zhuǎn)染 BMPsⅡ突變受體的 Tca8113 細胞，通過 G-418 篩選，初步確認(rèn)了表達突變受體的細胞克??；再用 neo 基因檢測，進一步證實了轉(zhuǎn)染的成功。這表明轉(zhuǎn)染 BMPsⅡ突變受體的 Tca8113 細胞已被建立，也進一步表明 Tca8113 細胞是 BMPs 的靶細胞，BMPs 及其受體可能在口腔上皮組織的惡變過程中有重要作用。我們將轉(zhuǎn)染成功的 Tca8113 細胞命名為 tBRII-Tca8113 細胞。

轉(zhuǎn)染前后穩(wěn)定表達 BMPsⅡ型突變受體的 tBRII-Tca8113 細胞和Tca8113 細胞相比，形態(tài)未見明顯變化，但是通過 MTT、流式細胞儀及反應(yīng)細胞 DNA 增殖水平的 BrdU 檢測，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后，細胞的增殖活力明顯下降。轉(zhuǎn)染 BMPsⅡ型突變受體后，細胞內(nèi)的 BMPs 信號分子的表達被阻斷，同時細胞的增殖出現(xiàn)下降，兩者間有何相關(guān)性，以往的相關(guān)研究顯示，BMPs 信號表達水平在口腔鱗癌組織中較口腔正常上皮組織有明顯增強,結(jié)合本實驗的結(jié)果推斷 BMPs 信號表達水平的改變在上皮細胞的惡變過程中起著相當(dāng)?shù)拇龠M作用，而不僅僅是由于其他因素導(dǎo)致 BMPs 信號表達水平的改變。

細胞周期是細胞生命活動的基本過程，細胞在周期時相的變遷中進入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)。對細胞周期調(diào)控的研究使人們認(rèn)識到，細胞周期失控是癌變的重要原因[9]。細胞周期的調(diào)控機制十分復(fù)雜，主要受到3類因子的調(diào)控，即細胞周期蛋白（cyclins）、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）和細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制蛋白（cyclin dependent kinase inhibitors，CKIs）組成，其中細胞周期蛋白是調(diào)節(jié)亞基，CDKs是催化亞基，在調(diào)控細胞周期的進程中，常暫時結(jié)合形成復(fù)合物而發(fā)揮作用，CKIs是近年來剛分離得到的一類很重要的細胞周期的負性調(diào)控蛋白，這些蛋白在體外通過與CDKs、cyclins或cyclin-cdks復(fù)合物結(jié)合達到抑制CDK催化外源性底物的活性。目前已知的細胞周期蛋白和CDKs包括 cyclinsA，B1-2，C，D1-3，E，F(xiàn)，G，H和CDKs1-7[10-11]。而CKIs可分為兩個族 ：第一族包括p15、p16、p18 、p19，這些蛋白內(nèi)包含獨特的四次錨蛋白結(jié)構(gòu)（這個名稱有無錯誤需咨詢）；第二族包括p21、p27、p57，它們在氨基N端有顯著的序列同源性，均有一個廣譜的cyclin-cdks復(fù)合物作用位點[11-12]。正常情況下，Cyclin D1在G1期是恒定的，其過量表達可導(dǎo)致G1期縮短，細胞分裂速度加快。對肝細胞癌、胃腸癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、骨腫瘤的研究表明，Cyclin D1在這些腫瘤中均有過量的表達[10]。

Cyclin D1和CDK4在腫瘤細胞的細胞周期循環(huán)發(fā)生障礙，Cyclin D1表達產(chǎn)物的堆積將使腫瘤細胞的G1期縮短，引起細胞的過度增殖。本研究顯示，轉(zhuǎn)染了突變受體的口腔舌癌細胞tBRII-Tca8113中Cyclin D1和CDK4的表達均顯著低于正常的 Tca8113 細胞，此外，細胞周期復(fù)性調(diào)控蛋白p27和p57的表達高于正常的Tca8113細胞。該結(jié)果與前述研究4項吻合，表明轉(zhuǎn)染了 BMPsⅡ型突變受體后，BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的改變與細胞周期相關(guān)因子的表達有較強的相關(guān)性。即轉(zhuǎn)染了 BMPsⅡ型突變受體后，腫瘤細胞的增殖顯著減弱，表明BMPs信號的表達在口腔舌癌細胞的惡性變化中起著重要作用。此外，在tBRII-Tca8113細胞中凋亡的表達與Tca8113細胞相比增強，BMPs信號的改變影響了癌細胞中凋亡機制的表達，細胞的惡性程度發(fā)生了改變。

BMPs信號的表達在口腔舌癌的惡性變化中起著重要作用,本研究結(jié)果有可能對口腔舌癌的基因治療提供新的思路。

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