龐榮清 何潔 李福兵 趙晶 阮光萍 王桂華 瞿良 李黎 蔡學(xué)敏 潘興華

自從Friedenstein等[1]首次從骨髓中分離和描述了成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（即間充質(zhì)干細(xì)胞）以來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSC）成為研究最多的成體干細(xì)胞之一。但BMMSC存在采集骨髓數(shù)量有限、捐獻(xiàn)者需要承受一定的痛苦，且細(xì)胞活性受捐獻(xiàn)者年齡影響等局限性[2-3]。隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，需要尋找間充質(zhì)干細(xì)胞的更好來(lái)源。McElreavey等[4]首次發(fā)現(xiàn)人臍帶組織中存在大量間充質(zhì)干細(xì)胞以來(lái)，人們采用組織貼塊法和酶消化法分離到了大量臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cell,UCMSC），大大促進(jìn)了UCMSC的研究，但這些方法還需進(jìn)一步改進(jìn)完善。本研究嘗試建立一種更加簡(jiǎn)單的分離方法，更方便地獲得UCMSC。

材料與方法

一、主要試劑和設(shè)備

含2 m mol/L的Glutamine的DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）和0.25﹪trypsin-EDTA均為美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)；流式單抗CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD90-FITC和CD105-FITC均為美國(guó)NeoMarkers公司生產(chǎn)；成脂、成骨和成軟骨分化誘導(dǎo)試劑盒均是美國(guó)Cyagen公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡下為日本NIKON公司生產(chǎn)；流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，在征得產(chǎn)婦和家屬知情同意的情況下，在解放軍昆明總醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)房取健康足月生產(chǎn)的新生兒臍帶（乙型肝炎病毒、丙肝病毒感染、人類免疫缺陷病毒、TP-SX、巨細(xì)胞病毒檢測(cè)陰性），放入盛有100ml生理鹽水的潔凈玻璃瓶中，于1h之內(nèi)送至細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌條件下參照Bruyn等[5]報(bào)道的方法分離培養(yǎng)UCMSC。即用含雙抗的生理鹽水反復(fù)沖洗臍帶以棄除血漬，先將臍帶剪斷為5 cm長(zhǎng)的小段，用小剪刀反復(fù)剪碎臍帶為糊狀，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入少許含有10﹪FBS的DMEM/F12使其均勻分布，于5﹪CO2、37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，2 d后小心吸棄培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況并拍照。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80﹪～90﹪融合狀態(tài)時(shí)，用0.25﹪trypsin-EDTA消化傳代細(xì)胞，記為第一代細(xì)胞（P1）。

三、細(xì)胞免疫表型的流式細(xì)胞分析

消化收集生長(zhǎng)良好的第二代細(xì)胞（P2），生理鹽水洗滌2次，分成每管含5×105細(xì)胞，分別加入 CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC 和同型對(duì)照10μl，4℃避光孵育30min，磷酸鹽緩沖液洗滌后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析抗原標(biāo)志的表達(dá)。

四、細(xì)胞分化潛能的鑒定

根據(jù)成脂、成骨和成軟骨分化誘導(dǎo)試劑盒說(shuō)明書介紹的方法，消化收集生長(zhǎng)良好的P2細(xì)胞進(jìn)行體外分化實(shí)驗(yàn)，然后分別進(jìn)行油紅O染色、茜素紅染色和阿新藍(lán)染色鑒定。

結(jié) 果

一、UCMSC的分離培養(yǎng)

采用剪碎臍帶為糊狀直接加入含10﹪FBS的DMEM/F12貼壁培養(yǎng)的方法，7 d以后可以在光鏡下觀察到少數(shù)長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞或從小組織塊周圍長(zhǎng)出少許貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，15 d可見(jiàn)大量長(zhǎng)梭形細(xì)胞散開(kāi)分布或圍繞組織塊呈克隆狀生長(zhǎng)。Trypsin-EDTA消化傳代后大量細(xì)胞均勻分布生長(zhǎng)至大部分融合狀態(tài)時(shí)，可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞呈漩渦狀生長(zhǎng)，呈現(xiàn)明顯的方向性，顯示與BMMSC類似的典型形態(tài)特征（圖1），初步判斷這些貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞就是間充質(zhì)干細(xì)胞，即UCMSC。

圖1 UCMSC在光鏡下的形態(tài)特征

二、細(xì)胞免疫表型分析

為了明確臍帶來(lái)源貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞是否與BMMSC 具有相同的抗原標(biāo)志表達(dá)，將上述原代培養(yǎng)細(xì)胞消化傳代 2次，擴(kuò)增培養(yǎng)至足夠數(shù)量的P2細(xì)胞，收集后加入CD29、CD34、CD44、CD90和CD105流式單抗進(jìn)行染色，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示，上述細(xì)胞不表達(dá)CD34，而高表達(dá)CD29、CD44、CD90和CD105（圖2），即表達(dá)了BMMSC的常見(jiàn)抗原標(biāo)志。

三、分化潛能鑒定

圖2 UCMSC的免疫表型分析

圖3 UCMSC的誘導(dǎo)分化鑒定

為了鑒定來(lái)源于臍帶的這些貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的體外分化能力，取P2細(xì)胞，做成細(xì)胞爬片，加入成脂分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)28 d后，可在光鏡下觀察到大量脂滴的分泌，小心吸棄油培養(yǎng)液并用4﹪多聚甲醛固定后加入油紅O染色，可見(jiàn)脂滴被染成紅色（圖3a），即成脂分化陽(yáng)性；同樣，做成細(xì)胞爬片，加入成骨分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)21d后，可在光鏡下觀察到白色結(jié)節(jié)，即鈣質(zhì)沉積結(jié)節(jié)，吸棄培養(yǎng)液后加入茜素紅染色，可見(jiàn)鈣質(zhì)結(jié)節(jié)被染成紅色（圖3b），即成骨分化陽(yáng)性；采用細(xì)胞團(tuán)塊培養(yǎng)方法，加入成軟骨分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)14 d后，吸棄培養(yǎng)液并用4﹪多聚甲醛固定后，石蠟包埋做病理切片，脫蠟后加入阿新藍(lán)染色，可見(jiàn)大量氨基葡聚糖被染成藍(lán)色（圖3c），即成軟骨分化陽(yáng)性。這些結(jié)果表明來(lái)源于臍帶的這些貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞具備向脂肪、骨、軟骨分化的能力，即具有類似于BMMSC的體外分化潛能。

討 論

臍帶是連接胎兒臍部與胎盤之間的索狀結(jié)構(gòu)組織，在胎兒正常分娩時(shí)被當(dāng)作廢棄物丟棄。利用臍帶來(lái)分離擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞屬于變廢為寶，幾乎不涉及倫理道德問(wèn)題，取材十分方便，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞；其次，UCMSC比較原始，增殖分化能力強(qiáng)，不像BMMSC那樣容易受到供體年齡的限制[3，6]；此外，由于胎盤屏障的存在，使得臍帶受到各種病原微生物感染的機(jī)會(huì)較低。因此，UCMSC是一種來(lái)源充足、活性好、相對(duì)比較安全和容易標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的種子細(xì)胞，必將成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，但是UCMSC分離擴(kuò)增的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)值得深入研究。

自從人們發(fā)現(xiàn)UCMSC以來(lái)，主要以酶消化法和組織貼塊法分離培養(yǎng)UCMSC，但酶消化法存在酶的濃度和消化時(shí)間控制不好可能會(huì)損傷細(xì)胞膜、降低細(xì)胞活性甚至改變細(xì)胞功能，而且操作繁瑣，不符合組織培養(yǎng)的基本原則，因?yàn)椴僮髟椒爆?，污染的機(jī)會(huì)就越多，細(xì)胞突變的幾率也越大。組織貼塊法是目前國(guó)內(nèi)外一些實(shí)驗(yàn)室分離UCMSC的基本方法，通常將臍帶切為數(shù)個(gè)立方毫米大小的小塊，然后轉(zhuǎn)移至含有多種生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)[7]，或用酶消化幾個(gè)立方毫米的小塊后再直接用含20﹪FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)[8]，就可分離到UCMSC。本研究認(rèn)為從簡(jiǎn)單、方便的組織培養(yǎng)原則出發(fā)，上述這些組織貼塊法還可以進(jìn)一步改進(jìn)完善。

本研究結(jié)果表明，將新鮮臍帶直接剪碎為糊狀后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，加入僅含10﹪FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，就可分離到大量貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，免疫表型分析結(jié)果顯示這些細(xì)胞高表達(dá)了BMMSC常見(jiàn)的抗原標(biāo)志CD29、CD44、CD90、CD105，而且體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些細(xì)胞至少具有向脂肪、骨和軟骨分化的能力，即具有多向分化潛能，這些結(jié)果與Bruyn等[5]報(bào)道的結(jié)果一致。根據(jù)間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[9]，可以判定這些貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞就是UCMSC。本研究的分離方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）方法簡(jiǎn)單：洗凈血漬后，直接剪碎臍帶為糊狀，加入少許含10﹪FBS的DMEM/F12直接培養(yǎng)，操作步驟少，大大縮短了實(shí)驗(yàn)室處理的時(shí)間，而且分離方法容易標(biāo)準(zhǔn)化；（2）經(jīng)濟(jì)實(shí)用：分離培養(yǎng)UCMSC的過(guò)程中不使用膠原酶，也不使用價(jià)格昂貴的各種細(xì)胞因子，胎牛血清的比例也僅為10﹪，分離成本低；（3）成功率高：從本質(zhì)上而言，本研究建立的方法也屬于組織貼塊法，但將臍帶剪碎為糊狀，組織塊更小，組織塊接觸培養(yǎng)瓶的面積增大，有利于UCMSC的貼壁生長(zhǎng)，分離UCMSC的成功率更高；（4）安全性好：由于UCMSC具有比骨髓等其它來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞更多的優(yōu)勢(shì)，UCMSC很快就成為人們關(guān)注的重點(diǎn)，很自然其安全性也更受人們關(guān)注。

與所有干細(xì)胞一樣，如何防范UCMSC的污染和變異就是人們關(guān)注的一個(gè)重點(diǎn)。怎樣才能最大限度地降低干細(xì)胞污染和變異的風(fēng)險(xiǎn)呢？本研究認(rèn)為盡量減少對(duì)干細(xì)胞的干預(yù)處理是最大限度地降低干細(xì)胞污染和變異的根本方法，比如簡(jiǎn)化體外分離操作環(huán)節(jié)，就可大大降低污染的幾率，減少各種“外來(lái)物質(zhì)”的接觸，這也是國(guó)家衛(wèi)生部《人的體細(xì)胞治療申報(bào)臨床試驗(yàn)指導(dǎo)原則》的基本要求——盡量避免異體血清、細(xì)胞因子和抗生素等“外來(lái)物質(zhì)”的使用，當(dāng)然酶消化法中常用的各種酶也屬于“外來(lái)物質(zhì)”的范疇，減少這些“外來(lái)物質(zhì)”的使用和接觸，既可降低細(xì)胞變異的幾率，又可有效防止各種病原微生物的傳播。因此，本研究采用直接剪碎臍帶分離UCMSC的方法對(duì)細(xì)胞干預(yù)處理最少，安全性更高。

不剝離血管組織直接貼壁培養(yǎng)獲得的細(xì)胞純度如何呢？細(xì)胞免疫表型分析結(jié)果表明，本研究獲得的P2細(xì)胞純度很高，原因在于傳代培養(yǎng)一直是純化BMMSC的重要手段，傳代培養(yǎng)可以淘汰雜細(xì)胞，傳代也可達(dá)到純化UCMSC的目的，這一解釋被Bruyn等[5]研究證實(shí)，采用不剝離血管組織直接貼壁培養(yǎng)獲得的原代UCMSC的確中存在大約20﹪的CD31陽(yáng)性表達(dá)的內(nèi)皮祖細(xì)胞，但傳代2代后這些細(xì)胞就完全消失了。Bruyn等還認(rèn)為，剝離血管組織再培養(yǎng)的方法會(huì)丟失血管組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞，因?yàn)槟殠а芙M織中原本就存在間充質(zhì)干細(xì)胞[10]，從臍靜脈內(nèi)皮下膜分離間充質(zhì)干細(xì)胞本身就是可行的方法[11]。此外，我們認(rèn)為就算獲得的UCMSC中殘留一些血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，在用于臨床治療某些缺血性疾病時(shí)或許效果更佳，因?yàn)檠茉偕鷻C(jī)制是干細(xì)胞發(fā)揮治療效果的重要途徑之一，而內(nèi)皮祖細(xì)胞正是血管再生的執(zhí)行者[12]。綜上所述，本研究建立的不剝離血管組織直接貼壁培養(yǎng)獲得UCMSC的方法，具有簡(jiǎn)單易行的特點(diǎn)，適于推廣使用。

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