許憶峰 楊曉鳳 吳雁翔 王紅梅 張軼斌 呂乃武 單鴻 崔激平 周金旭

缺血性下肢血管病變主要包括糖尿病足（diabetic foot,DF）、下肢動脈硬化閉塞癥（atherosclerosis occlusion,ASO）、血栓閉塞性脈管炎（thromboangiitis,TAO）等，其表現(xiàn)為間歇性跛行、下肢的靜息痛、潰瘍及壞疽等，嚴重時需截肢甚至威脅生命，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。由于其高危因素如老齡、糖尿病、吸煙、高血壓和肥胖等因素的持續(xù)存在，該發(fā)病率有持續(xù)上升趨勢。由于血管閉塞的情況復雜，單一的血管搭橋、支架、血管擴張和超聲消融等治療方法效果不甚理想。近年來干細胞療法在缺血性下肢血管病變治療中的應用越來越多，為難治性的下肢血管病變帶來了新的希望[1]。我們對254例患有缺血性下肢血管病變的患者進行了自體骨髓單個核細胞移植治療，進行了為期1年的自身前后對照研究，現(xiàn)報道如下。

對象與方法

一、一般資料

2003年11月至2008年8月期間，254例患者入組，年齡18～90歲，平均(56.8±15.8)歲，男167例，女87例。經(jīng)臨床癥狀、體征、下肢血管彩超、CT血管造影（computed tomographic angiography,CTA）及動脈造影檢查等確診為缺血性下肢血管病變，其中DF 96例(37.8﹪)，ASO 86例(33.9﹪)，脈管炎72例(28.3﹪)，按足部病變Fontaine 分級Ⅱ期38例，Ⅲ期190例，Ⅳ期26例，合并冠心病72例，高血壓54例，血脂異常92例，腦梗死26例?；颊呔嬖诓煌潭鹊拈g歇性跛行、下肢疼痛和難以愈合的缺血性潰瘍等。

患者均接受常規(guī)藥物治療無效，且不適合行介入和搭橋手術(shù)，無嚴重心肝腎功能不全，無過敏體質(zhì)、腫瘤史，無嚴重急性感染，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

所有患者均接受抗血小板治療（如阿司匹林），部分患者接受鈣離子拮抗劑等降壓藥、他汀類調(diào)脂藥、胰島素或口服降糖藥物治療，疼痛劇烈的患者予用二、三階梯類止痛藥物（如曲馬多、羥考酮等），同時潰瘍患者接受常規(guī)清創(chuàng)、減壓、換藥治療，有感染患者根據(jù)藥敏使用廣譜抗生素治療穩(wěn)定感染，移植術(shù)前后的常規(guī)治療基本保持不變。

二、病情的評估

觀察移植術(shù)前后足部疼痛感覺、冷感、深感覺和間歇性跛行距離， 觀察潰瘍和壞疽情況。移植術(shù)前后用多功能紅外線體溫儀(瑞士Infraeye PICCOLO公司)檢測足部皮溫，深感覺測定儀(美國Bio-siometer公司)測定足部深感覺，多普勒血流探測儀（日本ES-1000SPM林電器株式會社）檢測踝肱比，雷度多導聯(lián)經(jīng)皮氧分壓測定儀(丹麥TCMTM400公司)測定足部經(jīng)皮氧分壓。病情進行Fontaine分期。所有檢測均在室溫（25.0±1.0）℃和濕度（50.0±20.0）﹪條件下進行，患者靜息至少15min后測定。所有的指標于術(shù)前及術(shù)后3、6和12個月時重復測定。隨訪中嚴密觀察是否有不良反應。

肢體感覺分級：（1）肢體疼痛分級標準：0級，無疼痛；1級：偶有疼痛；2級，經(jīng)常疼痛，不需或偶用一般止痛劑；3級，經(jīng)常疼痛，需經(jīng)常用一般止痛劑；4級，疼痛影響睡眠，一般止痛劑難以緩解，需用麻醉性鎮(zhèn)痛藥。本組下肢疼痛情況：0級8例；1級33例；2級79例；3級88例；4級46例。（2）肢體冷感分級標準：0級，無冷感；1級，偶有受累肢體發(fā)涼、怕冷感；2級，常有受累肢體發(fā)涼、怕冷感；3級，受累肢體有明顯冷、涼感，需要采用局部保溫措施，癥狀才能得到一定程度的緩解；4級，受累肢體有明顯的冷、涼感，采用局部保溫措施癥狀也無明顯改善。本組患者患肢均有不同程度的冷感，2級78例；3級99例；4級77例。（3）肢體跛行分級標準：按正常速度(60～70 m/min)行走。0 級，行走≥500 m，無疼痛；1級，行走400～499 m，有疼痛；2級，行走300～399 m，有疼痛；3級，行走100～299 m，有疼痛；4級，靜息痛，無法行走，或僅行走< 100 m，即有疼痛。本組0級22例，1級44例，2級62例，3級80例，4級46例。（4）潰瘍壞疽情況：本組合并潰瘍61例，壞疽26例。

三、自體骨髓單個核細胞的采集和治療方法

全部患者均使用rhG-CSF(吉粒芬，杭州九源藥業(yè)公司)5 mg·kg-1·d-1術(shù)前皮下注射共2 d，進行骨髓單個核細胞動員。監(jiān)測外周血常規(guī)值，干細胞動員第3天白細胞總數(shù)達（15.2～32.6）×109/L[平均（21.1±7.8）×109/L]。第3天行骨髓采集術(shù)，局部麻醉下從髂后上嵴抽取骨髓200ml，去除紅細胞，密度梯度離心，分離出單個核細胞，再將收獲的單個核細胞制成50ml左右的細胞懸液備用。計數(shù)細胞總量并測定CD34+及CD133+細胞含量（流式細胞儀，美國BD公司）。單次移植提取的單個核細胞總量平均為 ( 5.16±2.47)×108，其中 CD34+細胞含量為 (4.24±2.16)﹪，CD133+細胞含量為( 1.89±1.52)﹪。在手術(shù)室進行細胞移植術(shù)，將采集的單個核細胞配制成濃度為2.16×1010/L的細胞混懸液，依大血管走行，足部按1 cm×1 cm 間距行肌肉注射，小腿部位按3 cm×3 cm 間距，肌肉注射。

四、隨訪指標

所有患者均隨訪12個月。治療前及治療后3、6和12個月分別進行以下指標觀察：（1）疼痛、冷感和跛行距離，觀察潰瘍和壞疽情況。（2）皮溫、深感覺、經(jīng)皮氧分壓和踝肱比。

五、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。計量資料用表示，皮溫等指標的組間比較采用F檢驗，與基線組比較采用LSD檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、患者癥狀及體征變化(表1、表2)

（1）疼痛情況：疼痛消失18例(Ⅱ期18例)， 緩解139例(Ⅱ期17例，Ⅲ期112例，Ⅳ期10例)，無緩解97例(Ⅱ期3例，Ⅲ期78例，Ⅳ期16例)。緩解率61﹪(157 /254 )。（2）冷感情況：冷感緩解188例(Ⅱ期29例，Ⅲ期144例，Ⅳ期15例)，無緩解66例。緩解率74﹪(188 /254 )。（3）跛行情況：跛行延長102例(Ⅱ期23例，Ⅲ期72例，Ⅳ期7例)。好轉(zhuǎn)率40﹪(102 /254 )。（4）潰瘍情況：愈合18例，縮小18例，無變化15例，擴大10例。好轉(zhuǎn)率59.0﹪(36 /61)。(5)壞疽情況：截肢6例，脫落愈合5例，無變化8例，擴大7例(圖1、2)。

表1 254例不同F(xiàn)ontaine分期患者術(shù)后病情變化（例）

表2 254例不同F(xiàn)ontaine分期患者手術(shù)前后病情變化分級（例）

圖1 缺血性下肢血管病變致右足潰瘍患者干細胞治療前后對比（一）

圖2 缺血性下肢血管病變致右足潰瘍患者干細胞治療前后對比（二）

二、患者客觀檢查指標變化

患者移植部位的皮溫、經(jīng)皮氧分壓及踝肱比均有升高(t=13.32，t=5.157，t=8.104)， 深感覺閾值降低（t=4.901）， P值均< 0.01，差異有統(tǒng)計學意義（表3）。

表3 254例不同F(xiàn)ontaine分期患者治療后皮溫、深感覺、踝肱比及經(jīng)皮氧分壓值（）

表3 254例不同F(xiàn)ontaine分期患者治療后皮溫、深感覺、踝肱比及經(jīng)皮氧分壓值（）

注：a與基線值相比 P < 0.05

移植后時間 皮溫(℃) 深感覺(mV) 踝肱比 經(jīng)皮氧分壓(mm Hg)基線值 32.89±2.19 26.20±15.70 0.62±0.36 26.46±18.401周后 32.86±2.66 26.30±15.60 0.63±0.36 26.51±18.403個月后 34.05±1.76a 23.17±13.50a 0.72±0.30a 29.47±16.58a 6個月后 34.86±1.67a 21.59±12.00a 0.79±0.26a 31.80±15.60a 12個月后 35.52±2.26a 20.34±10.80a 0.84±0.24a 34.14±14.99a

三、不良事件

所有患者治療后1～3 d 局部注射處有不同程度的脹痛， 無其他異常癥狀體征出現(xiàn)，心電圖和肝腎功能無特殊改變。

討 論

缺血性下肢血管病變是一種危害健康、降低患者生活質(zhì)量、致殘率較高的疾病，傳統(tǒng)的藥物、血管搭橋、介入手術(shù)和截肢術(shù)等治療方法均有局限性。干細胞技術(shù)是近年出現(xiàn)的一項新方法，發(fā)展迅速并已有許多臨床研究。根據(jù)發(fā)育階段的不同，干細胞可分為胚胎干細胞與成體干細胞，成體干細胞根據(jù)其來源可分為骨髓干細胞、外周血干細胞、臍血干細胞及臍帶干細胞等，根據(jù)干細胞分化組織不同還可分為造血干細胞及間充質(zhì)干細胞，干細胞技術(shù)臨床應用的理論基礎是干細胞具有分化潛能，可分化成各種機體組織細胞，包括成血管細胞和血管內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）[2]，并進一步分化形成新生毛細血管[3]。

對于骨髓干細胞的研究目前相對較多，研究證實骨髓細胞可分泌諸如堿性成纖維細胞生長因子和白細胞介素1β等促進血管生成因子[4-5]。有動物實驗表明，對缺血肢體行骨髓干細胞移植后，有新的血管內(nèi)皮細胞及血管形成[6]。自體干細胞移植治療缺血性下肢血管病變即利用此原理，將干細胞移植至缺血足部，使其分化形成新生毛細血管，改善并恢復局部血流。Tateishi-Yuyama等[7]最早使用骨髓單個核細胞(含內(nèi)皮祖細胞)注射治療因周圍血管病導致的下肢缺血，治療4周后，患者踝肱指數(shù)明顯提高。動物實驗顯示將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染的骨髓單核干細胞移植到小鼠皮膚創(chuàng)傷處，局部環(huán)境可刺激干細胞移入，并分化為皮膚各種細胞和結(jié)構(gòu)，表明骨髓單核干細胞移植可修復皮膚潰瘍[8]。且骨髓單核干細胞也可通過釋放促血管形成因子，促進潰瘍愈合。2003年谷涌泉等[9]在國內(nèi)首先開展了自體骨髓單個核細胞移植治療下肢缺血的臨床研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者達到了避免截肢或降低截肢平面的目的。其后來的臨床應用研究認為，自體骨髓單核干細胞移植治療下肢缺血性疾病具有一定的療效，而且療效與移植干細胞總量有密切關(guān)系[10]。楊曉鳳等[11]認為經(jīng)動員后采用血細胞分離機采集的外周血單核干細胞，CD34+、CD133+細胞總數(shù)明顯高于BMSCs，疼痛和冷感改善較BMSCs迅速，但干細胞移植前后臨床癥狀及檢查指標兩組未見明顯差異，且進行血細胞單采及大劑量骨髓動員劑對患者的身體狀態(tài)要求相對較高，高齡及并發(fā)癥較多的患者風險較大，骨髓采集則相對風險略小。李學峰等[12]對于血栓閉塞性脈管炎采用自體骨髓干細胞移植治療，取得良好效果；很多臨床研究都有力的支持了骨髓干細胞治療缺血性下肢血管病變的療效及安全性[13-14]。另外骨髓動員劑G-CSF刺激骨髓生成，使骨髓干細胞釋放至外周血中EPC 數(shù)量增加[15]，趨化到缺血局部的EPC 相應增加[16]；可能亦會促進缺血局部的血管生成。本組觀察發(fā)現(xiàn)移植后患者疼痛、冷感明顯緩解，跛行距離延長，潰瘍愈合或減小，足部和下肢皮溫、踝肱比及經(jīng)皮氧分壓均升高，深感覺改善。因此我們認為自體骨髓單個核細胞移植是一種有效治療下肢缺血性血管病的方法，尤其對非終末期患者改善癥狀明顯，可促進潰瘍愈合，無排斥反應，無明顯副作用及并發(fā)癥。

對于自體骨髓單個核細胞移植現(xiàn)在仍有許多問題有待進一步明確：（1）移植細胞的數(shù)量、種類、移植途徑與療效的關(guān)系；（2）移植干細胞的質(zhì)量檢測、動員多長時間為最適當；（3）如何分離較純的CD34+細胞及體外增殖干細胞；（4）骨髓刺激后干細胞亞群如何變化，細胞因子在其中發(fā)揮何種作用，對缺血局部炎癥反應及新生血管內(nèi)皮細胞功能有何影響；（5）是否會出現(xiàn)遠期并發(fā)癥以及有沒有致腫瘤的可能等。對以上問題的進一步研究有助于探討自體骨髓單個核細胞移植改善下肢缺血的機制，為進一步提高自體骨髓單個核細胞移植治療下肢缺血的療效提供理論基礎。而隨著研究的深入，相信這些問題會逐漸得到解決。

1 王愛紅,許樟榮.干細胞移植——治療糖尿病缺血性下肢血管病變的新手段[J].國外醫(yī)學：內(nèi)分泌學分冊,2005,6:430-432.

2 Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275:964-967.

3 趙玉國,金畢,李毅清.自體骨髓干細胞移植誘導血管生成的作用[J].華中醫(yī)學雜志,2004,28(3):173-174.

4 Shi Q,Rafii S,Wu MH,et al.Evidence for circulation bone marrow derived endothelial[J].Blood,1998,92(2):362.

5 Hamano K,Li TS,Kobayashi T,et al.The induction of angiogenes is by the implantation of autologous bone marrow cells:A novel and simple therapeutic method[J].Surgery,2001,130(1):44.

6 Kawamoto A,Asahara T,Losordo DW,et al.Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization[J].Cardiovasc Radiat Med,2002,3(3-4):221-225.

7 Tateishi-Yuyama E,Matsubara H,Murohara T,et al.Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial[J].Lancet,2002,360(9331):427-435.

8 Wu Y,Chen L,Scott PG,et al.Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis[J].Stem Cells,2007,25(10):2648-2659.

9 谷涌泉,張建,齊立行,等.自體骨髓單個核細胞移植治療慢性下肢缺血94例不同病變分期患者的效果比較[J].中國臨床康復,2005,9 (38):7-10.

10 谷涌泉,張建,齊立行,等.不同移植濃度自體骨髓干細胞治療下肢缺血臨床療效的影響[J].中國修復重建外科雜志,2006,20(5):504-506.

11 楊曉鳳,吳雁翔,王紅梅,等.自體外周血和骨髓干細胞移植對缺血性下肢血管疾病患者缺血狀態(tài)改善的臨床研究[J].中國實用內(nèi)科雜志,2007,27(14):1126-1129.

12 李學鋒,沈振亞,谷涌泉,等.自體骨髓干細胞移植治療血栓閉塞性脈管炎[J].中國普外基礎與臨床雜志,2010,17 (7):656-658.

13 許憶峰,楊曉鳳,吳雁翔,等.自體骨髓干細胞移植治療下肢缺血性疾病:43例6個月后療效評估,中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(3):534-535.

14 曾昭凡,唐新華,熊吉信,等.自體骨髓干細胞移植治療下肢慢性缺血性疾病的療效觀察[J].中國普通外科雜志,2010,19(6):646-650.

15 Leone AM,Valgimigli M,Giannico MB,et al.From bone marrow to the arterial wall: the ongoing tale of endothelial progenitor cells[J].Eur Heart J,2009,30(8):890-899.

16 Schimieguel DM,Dominato JA,Zattar KC,et al.Does mobilization for autologous stem cell transplantation damage stromal layer formation[J].Hematology,2009,14(2):76-83.