江藝 張小進 呂立志 楊芳 蔡秋程 潘凡

肝移植術后長期應用免疫抑制劑是保持移植物長期存活的重要手段[1]。然而，這不僅增加受者沉重的經濟負擔，也會誘發(fā)感染、腫瘤、肝腎功能損害和糖尿病等并發(fā)癥，部分患者仍發(fā)生排斥反應。近年來，許多學者對通過何種手段既避免受者排斥移植器官的發(fā)生，又終止或減少免疫抑制劑的應用進行了諸多的研究，同源骨髓干細胞聯(lián)合器官移植是目前研究的熱點之一[2]。然而，實質器官移植中，肝臟為所謂的 “免疫豁免”器官，其排斥反應的發(fā)生輕于腎臟[3]，因此，同源骨髓干細胞聯(lián)合器官移植誘導免疫耐受的實驗研究，以及骨髓干細胞聯(lián)合腎臟移植的臨床研究受到了更早和更多的重視。研究證實，骨髓干細胞聯(lián)合腎臟移植受者對移植腎臟表現出免疫耐受，術后無需長期服用免疫抑制劑[4-5]。在動物實驗的基礎上，2008年3月至2009年1月本中心課題組開展了同期供體骨髓干細胞聯(lián)合肝臟移植8例，并與同期開展的常規(guī)肝移植患者進行對比，報道如下。

對象與方法

一、病例選擇

2008年3月至2009年1月本中心行肝移植30例，其中8例同期供體骨髓干細胞聯(lián)合肝移植的受者為實驗組，其余僅行同種異體肝移植的22例受者為對照組。實驗組8例患者對實施同期供體骨髓干細胞輸注均知情同意，各例供者均為志愿捐贈的腦死亡者，受者對肝移植手術均知情同意，整個過程經我院倫理委員會審批同意。兩組受者基本情況（表 1）。

二、方法

1.供體骨髓干細胞采集方法：參照馮曉勤等[6]的方法并適當改進：(1)腦死亡供者行肝腎聯(lián)合快速切取結束后，再次消毒雙側腹股溝區(qū)和臀外側，沿髂前上棘切開皮膚、皮下組織和肌肉，剔除附著在髂骨上的大部分肌肉，用骨科線鋸分別從左右側髂嵴上截取約8 cm×4 cm大小的髂骨塊各一，立即無菌保存于0～4℃ 300ml HTK 液（含有 1.25 萬單位肝素納）中運送；(2)回手術室后，剝凈附著于髂骨的肌肉組織,咬骨鉗將髂骨咬成約 1 cm×1 cm 大小，500ml 乳酸鈉林格氏液洗滌 2 遍，再反復沖洗骨髓腔，直至骨變白。雙層紗布過濾洗滌液，置入50ml離心管中，4100×g離心10min收集骨髓細胞，棄上清，沉淀細胞用乳酸鈉林格氏液重懸，再經淋巴細胞分離液密度梯度離心，純化單個核細胞，離心洗滌3次，收集沉淀的骨髓細胞，濾網過濾1次。一般每個供體可以獲得（1～5）×109個單個核細胞。將其加入含有 5﹪人血白蛋白的生理鹽水100ml中備用。

表1 兩組間病例資料均衡性檢驗結果

2.骨髓干細胞檢測：從上述制備好的 100ml 液體中取出 2ml 進行檢測，有核細胞濃度為(1～5)×107/ml。流式細胞儀測定 CD34+細胞比例為1.5﹪～3.4﹪，推算采集的 CD34+細胞數為(3.5～14.0)×107/供體。

3.供體骨髓干細胞輸注：肝移植手術結束，生命體征平穩(wěn)后即可輸注與供肝同源的骨髓干細胞，每個受者輸注的單個核細胞數為 (1～5)×109個，經中心靜脈輸注，輸注時間 1h。輸注過程同時觀察受者生命體征、是否出現皮疹等。

4.免疫抑制劑方案：兩組受者肝臟血流開放前靜滴甲潑尼龍 500 mg。對照組術后第 1 天甲潑尼龍 320 mg，以后每天遞減 40 mg，至 40 mg 后改口服潑尼松 20 mg，每天 1次。實驗組術后第 1 天甲潑尼龍 320 mg，以后每天遞減 80 mg，至 80 mg后改口服潑尼松 20 mg，每天 1次。兩組均于術后第 2 天開始口服他克莫司，對照組起始量 0.075 mg·kg-1·d-1，實驗組 0.05 mg·kg-1·d-1，以后根據具體情況進行調整。若并發(fā)嚴重感染，則提前停用甲潑尼龍，他克莫司減量 50﹪以上。若發(fā)生排斥反應，則適當增加他克莫司用量，必要時甲潑尼龍 200 mg/d，沖擊治療 3 d。

5.觀測指標：（1）免疫抑制劑用量：甲潑尼龍總量、出院時他克莫司劑量；（2）住院期間急性排斥反應及感染并發(fā)癥發(fā)生情況；（3）肝功能恢復情況：術后第1、3、7天分別觀測血清丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、血清總膽紅素（total bilirubin,TBil）、谷氨酰轉肽酶 (γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT)、白蛋白 (albumin,Alb) 等 ；（4）住院時間、住院費用。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 11.0軟件分析，率的對比用確切概率法。兩均數間比較用t檢驗；成組設計多樣本均數的比較用兩因素方差分析，首先用Homogeneity of variance test進行方差齊性檢驗，多樣本均數間的兩兩比較用SNK (Student Newman Keuls)法檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、治療結果

全部 30例受者手術成功，出院率 100﹪。實驗組受者骨髓干細胞輸注過程無不良反應，亦未見明確的移植物抗宿主反應。

二、免疫抑制劑用量

實驗組和對照組甲潑尼龍總用量分別為(1314±105)mg和(1884±256)mg，出院時他克莫司用量分別為(3.73±0.35)mg/d和(4.93±0.62)mg/d,實驗組甲潑尼龍總用量和出院時每日他克莫司用量均低于對照組（t'=8.635,5.147,P=0.000）。

三、急性排斥和感染發(fā)生情況

實驗組和對照組 3 個月內急性排斥反應發(fā)生率分別為 0﹪（0/8）和18.2﹪(4/22)，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.314）。實驗組 3例（37.5﹪）發(fā)生感染，均為肺部細菌感染；對照組 10例（45.5﹪）發(fā)生感染，7例肺部感染，2例腹腔感染，1例膿毒血癥，均有細菌感染，其中 3例合并霉菌感染，兩組感染發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（P=0.978）。

四、肝功能恢復情況

術后第1天、第3天實驗組血清丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶均低于對照組，[術后第1天：谷氨酸轉氨酶分別為 (875.2±325.5) IU/L ，(1350.4±482.7) IU/L，t=2.543，P=0.016,天冬氨酸轉氨酶分別為 (646.2±184.9) IU/L，(1021.8±325.4) IU/L，t=3.067，P=0.005。術后第 3 天，谷氨酸轉氨酶分別為 (252.9±35.8) IU/L，(343.5±47.8) IU/L，t=4.866，P=0.000,天冬氨酸轉氨酶分別為(227.8±38.0) IU/L，(310.8±61.7) IU/L，t=3.545，P=0.001]術后第7天兩組間無顯著差異。兩組術后第1、3、7天血清總膽紅素、谷氨酰轉肽酶和白蛋白差異均無統(tǒng)計學意義（表2）。

五、住院時間和費用

實驗組和對照組住院時間分別為(24.6±10.5)d和(25.9±9.3)d；住院費用分別為(22.5±3.5)萬元和(24.8±8.6)萬元。兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義(t=0.328,t=1.040,P=0.746,P=0.307)。

表2 術后不同時間2組肝功能恢復情況（）

表2 術后不同時間2組肝功能恢復情況（）

注：ALT為丙氨酸轉氨酶，AST天冬氨酸轉氨酶,TBil為血清總膽紅素，Alb為白蛋白，γ-GT為谷氨酰轉肽酶，與對照組相比，aP < 0.01

組 別 例數 ALT（IU/L） AST(IU/L) TBil(g/L) Alb (g/L) γ-GT(μmol/L)第1天實驗組 8 875.2±325.5a 646.2±184.9a 69.6±34.3 29.4±4.2 98.5±31.1對照組 22 1350.4±482.7 1021.8±325.4 76.1±48.6 28.3±5.9 95.6±29.5第3天實驗組 8 252.9± 35.8a 227.8± 38.0a 85.6±38.3 34.2±9.2 115.9±36.5對照組 22 343.5± 47.8 310.8± 61.7 79.5±40.7 35.4±8.9 132.1±31.5第7天實驗組 8 72.1± 21.4 65.8± 18.4 58.2±26.5 38.2±8.2 94.9±35.7對照組 22 82.5± 24.0 79.4± 21.2 67.4±24.1 37.4±6.5 104.0±35.6

討 論

本研究結果顯示，接受同期骨髓干細胞輸注的肝移植受者術后免疫抑制劑用量明顯減少，早期肝細胞酶譜峰值更低，且未發(fā)生與骨髓干細胞輸注相關的并發(fā)癥。提示同期骨髓干細胞輸注有利于肝移植受者術后恢復。

一、骨髓來源干細胞與移植肝再生

骨髓是成體中干細胞含量最豐富的組織，包括多種具有向不同組織細胞分化潛能的干細胞群體，其中以造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSC)及間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)為主。骨髓來源干細胞(bone marrow-derived stem cells,BMDSC)同樣具有向肝內細胞分化的潛能，而且認為BMDSC是肝卵圓細胞的重要來源之一[7]。大量肝損傷動物模型的研究發(fā)現，骨髓移植后2 d損傷肝內即出現移植骨髓來源的肝細胞和膽管細胞，而且隨著時間的推移，這樣的再生細胞也逐漸增多[8]。人類骨髓移植也得到了同樣的結果，BMDSC參與實質細胞再生的效率可達40﹪，其中丙型肝炎肝損傷最重，BMDSC參與再生效率也最高[9]。部分肝切除一直是研究肝再生的經典模型，Fujii等[10]研究證實，70﹪肝切除后移植的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）標記的骨髓細胞，有70﹪參與肝竇內皮細胞(sinusoidal endothelia- lcells,SEC)的再生，而肝臟SEC在肝切除早期可以誘導增殖狀態(tài)的肝細胞及靜息狀態(tài)的肝細胞增殖。以上研究證實，BMDSC既可以直接參與肝實質細胞再生，也可以通過參與非實質細胞再生而促進肝功能恢復。本研究在肝移植術后數小時內將供者來源的骨髓干細胞一次性輸注給受者，術后肝功能恢復更快，可能由于部分供體干細胞直接參與再灌注損傷肝臟的再生與修復。

二、供者來源BMDSC與移植肝耐受

有報道顯示，大約20﹪的肝移植受者對移植肝可以產生自發(fā)免疫耐受，從而停止免疫抑制劑的應用，但是尚無法證實這些病例移植后不使用免疫抑制劑是安全的[11]。Mellgren等[12]和Susanne等[13]分別在應用CD34+干細胞治療先天遺傳病和血液病后，由于受者肝功能衰竭而進行同一供者來源的活體肝移植(living donor liver transplantation,LDLT)，結果發(fā)現移植肝耐受的發(fā)生，且移植后只需要小劑量應用免疫抑制劑，甚至可以完全停用。由此認為，同一供者來源的干細胞輸注在誘導移植肝免疫耐受中發(fā)揮了重要作用。但是，輸注之前應用放射或化學藥物進行骨髓抑制處理，會對機體造成毒性損傷，而且，造血干細胞輸注有引起移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的危險，在某種程度上限制了這一方法的應用。2004年，Donckier等[14]在給2例肝病患者行LDLT前，沒有進行骨髓抑制，而是先給受者輸注HLA配型不符的供者來源CD34+細胞，然后分別在輸注后第40 和55 天實施LDLT，結果誘導了供者特異性的免疫耐受，使肝移植物長期存活，而且沒有觀察到移植物抗宿主?。╣raft-versus-host diseaes,GVHD）的發(fā)生，證明HSC在這一治療中起到了關鍵作用。2006年，Donckier等[15]又進行了LDLT之后第7天輸注同一供者來源的干細胞的研究，也得到了同樣的結果，而且在術后早期停止了免疫抑制治療。以上報道中所輸注的CD34+干細胞均是從G-CSF動員后的供者外周血中收集而來，而成體中骨髓的HSC含量最豐富，故認為這些細胞最可能來源于骨髓。本研究是直接從供體髂骨中采集骨髓干細胞，獲得的單個核細胞的數量充足，通?？梢赃_到1×109個以上。移植后實驗組免疫抑制劑用量顯著減少，而且無明確的排斥反應發(fā)生，感染發(fā)生率較對照組為低。隨著病例數量的增加和觀察時間的延長，可能會獲得出更為滿意的結果。

同期供體骨髓干細胞是一種安全有效的治療方法。為了在臨床推廣應用供體骨髓干細胞輸注聯(lián)合肝臟移植這一新技術，除了保證供體骨髓干細胞采集和提取過程的絕對無菌、供受體血型相符外，尚需深入研究供體骨髓干細胞對肝移植受者免疫系統(tǒng)的影響，以及輸注時機和輸注方式等問題。

1 劉驊,曹暉,吳志勇.肝移植免疫耐受的研究進展[J].中華器官移植雜志,2005,26(6):381-382.

2 羅海英,王韞芳,孔維.骨髓來源干細胞在肝移植中的應用及其相關機制[J].科學通報,2007,52(16):1853-1858.

3 Wiesner RH,Rakela J,Ishitani MB,et al.Recent advances in liver transplantation[J].Mayo Clin Proc,2003,78(2):197-210.

4 Tatsuo Kawai,M.D,A.Benedict Cosimi,et al.HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression[J].N Engl J Med,2008,358(4):353-361.

5 Scandling JD,Busque S,Dejbakhsh-Jones S,et al.Tolerance and chimerism after renal and hematopoietic-cell transplantation[J].N Engl J Med,2008,358(4):407-411.

6 馮曉勤,李春富,何岳林.一種新的骨髓沖洗方法采集造血干細胞[G].第10屆全國實驗血液學會議論文摘要匯編,2005:266-267.

7 Petersen BE,Bowen WC,Patrene KD,et al.Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells[J].Science,1999,284(5417):1168-1170.

8 Oyagi S,Hirose M,Kojima M,et al.Therapeutic effect of transplanting HGF-treated bone marrow mesenchymal cells into CCl4-injured rats[J].J Hepatol,2006,44(4):742-748.

9 Theise N D,Nimmakayalu M,Gardner R,et al.Liver from bone marrow in humans[J].Hepatology,2000,32(1):11-16.

10 Fujii H,Hirose T,Oe S,et al.Contribution of bone marrow cells to liver regeneration after partial hepatectomy in mice[J].J Hepatol,2002,36(5):653-659.

11 Devlin J,Doherty D,Thomson L,et al.Defining the outcome of immunosuppression withdrawal after liver transplantation[J].Hepatology,1998,27(4):926-933.

12 Mellgren K,Fasth A,Saalman R,et al.Liver transplantation after stem cell transplantation with the same living donor in a monozygotic twin with acute myeloid leukemia[J].Ann Hematol,2005,84(11):755-757.

13 Susanne MM,Christina P,Alfred K,et al.Successful stem cell transplantation following orthotopic liver transplantation from the same haploidentical family donor in a girl with hemophagocytic lymphohistiocytosis[J].Blood,2000,96(12):3997-99.

14 Donckier V,Troisi R,Toungouz M,et al.Donor stem cell infusion after non-myeloablative conditioning for tolerance induction to HLA mismatched adult living-donor liver graft[J].Transpl Immunol,2004,3(5):139-146.

15 Donckier V,Troisi R,Le Moine A,et al.Early immunosuppression withdrawal after living donor liver transplantation and donor stem cell infusion[J].Liver Transpl,2006,12(10):1523-1528.