張馳，楊軍，劉新梅，王曉麗

（國家農(nóng)副產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 210028）

食品中3種致病菌的Taqman多重?zé)晒舛縋CR檢測

張馳，楊軍，劉新梅，王曉麗

（國家農(nóng)副產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 210028）

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTi-PCR）技術(shù)探索病原微生物的快速高通量檢測方法已是食品微生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。首先，通過調(diào)整混合培養(yǎng)基的配比摸索食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的快速共增菌條件，并選擇穩(wěn)定高效的細(xì)菌基因組DNA提取方法，然后根據(jù)3種目標(biāo)致病菌的保守基因分別設(shè)計(jì)RTi-PCR引物和雙標(biāo)記Taqman探針，分別使用FAM、TAMRA及CY5作為報(bào)告基團(tuán)，對致病菌進(jìn)行多重RTi-PCR檢測，并設(shè)計(jì)、構(gòu)建了陽性內(nèi)參用于檢測反應(yīng)體系。結(jié)果表明，方法針對42種已知目標(biāo)菌株和21種已知菌株組合特異性良好，檢測限可達(dá)101cfu/PCR反應(yīng)，且反應(yīng)體系各組分間未見交叉干擾。陽性內(nèi)參Ct值保持穩(wěn)定，有效地保證了檢測的可靠性。對人工污染的食品盲樣檢測驗(yàn)證了方法的實(shí)用性?？傊?，建立了一種食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌同時(shí)快速檢測的多重RTi-PCR方法，為食源性致病菌的檢測提供了新的方法學(xué)依據(jù)。

金黃色葡萄球菌；沙門氏菌；志賀氏菌；熒光定量PCR；陽性內(nèi)參

金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌是3種常見的食源性致病菌，也是我國食品國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中致病菌檢測的3項(xiàng)重要指標(biāo)。其中金黃色葡萄球菌是引起人類化膿性感染最常見的致病菌；沙門氏菌作為人畜共患的的腸道致病菌，其導(dǎo)致的食物中毒數(shù)量一直處于世界食物中毒病例前列；志賀氏菌通稱痢疾桿菌，是引起人類細(xì)菌性痢疾的主要病原菌[1-3]。目前，國家標(biāo)準(zhǔn)中對上述致病菌的檢測主要依靠傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定的方法，步驟復(fù)雜、檢測周期長，已不能完全適應(yīng)大規(guī)?？焖贆z測的需要。近十年來，隨著微生物分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTi-PCR）技術(shù)為食品中致病菌的高通量快速檢測開辟了新的途徑，相關(guān)的方法學(xué)研究國內(nèi)外已有大量探索[4-10]。然而，針對我國各類食品國標(biāo)中均須強(qiáng)制檢驗(yàn)的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌3種致病菌，其多重RTi-PCR檢測方法尚鮮見報(bào)導(dǎo)。此外，目前國內(nèi)對食品中致病菌的RTi-PCR檢測研究均缺乏陽性內(nèi)參（IPC）對反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。因此，建立以多重RTi-PCR為基礎(chǔ)的食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的快速同時(shí)檢測方法將具有一定的實(shí)踐意義。首先，探索食品中3種目標(biāo)致病菌的同時(shí)快速增菌策略，并選擇穩(wěn)定高效的細(xì)菌基因組DNA提取方法，然后根據(jù)3種致病菌的保守基因分別設(shè)計(jì)引物和Taqman熒光探針，進(jìn)行多重RTi-PCR檢測方法的探索和優(yōu)化，同時(shí)自行設(shè)計(jì)、構(gòu)建作為陽性內(nèi)參的重組DNA監(jiān)測反應(yīng)體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DNA微量定量試劑盒：美國Invitrogen公司；Taq酶及緩沖液：日本Takara公司；培養(yǎng)基：均購自北京陸橋；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、溶菌酶、蛋白酶K等：均購自南京生興；引物與雙標(biāo)記Taqman探針均委托上海生工公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

快速熒光定量PCR儀，ABI 7500 Fast，美國ABI公司；PCR儀，美國ABI公司；高速離心機(jī)，Sigma3-18K，美國Sigma公司。

1.3 沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的同時(shí)快速增菌

將金黃色葡萄球菌CECT86T、沙門氏菌S34和志賀氏菌ATCC8700各1×101cfu同時(shí)加入1 mL原奶或10%豬肉勻漿以制備人工污染食品樣本。分別配制GN培養(yǎng)基和 7.5%NaCl肉湯體積比為 1:1、1:2、2:1、1:3、3:1的混合培養(yǎng)基。將人工污染的食品分別加入10mL上述混合培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)6 h后10倍梯度稀釋并分別涂布于3種致病菌的分離培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h后對3種致病菌分別計(jì)數(shù)，以確定最佳共增菌培養(yǎng)基的配比。

1.4 細(xì)菌基因組DNA提取與定量

將快速增菌后的培養(yǎng)物10 mL 5000 r/min離心10 min，去上清，分別使用Qiagen柱離心式細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒和手工溶菌酶-蛋白酶K法提取細(xì)菌基因組DNA。柱離心法提取步驟遵照Qiagen公司試劑盒說明書；溶菌酶-蛋白酶K法按照《分子克隆》第三版操作，并用酚/氯仿抽提。使用DNA微量定量試劑盒測定細(xì)菌基因組DNA的濃度和純度。

1.5 RTi-PCR引物與雙熒光標(biāo)記探針

我們分別針對金黃色葡萄球菌的nuc基因、沙門氏菌的OriC基因和志賀氏菌的ipaH基因，利用Primer Express（ABI）軟件設(shè)計(jì) RTi-PCR 引物和Taqman探針序列，分別使用熒光基團(tuán)FAM、TAMARA及CY5作為探針的發(fā)光基團(tuán)，以對應(yīng)于熒光定量PCR儀的不同波長段用于同時(shí)檢測。引物與探針序列見表1。

1.6 陽性內(nèi)參DNA的構(gòu)建

截取人對氧磷酶1（PON1）基因cDNA的893-964位序列，通過3輪PCR擴(kuò)增在其上、下游分別連接志賀氏菌RTi-PCR檢測的引物結(jié)合序列，再將此重組基因克隆至PUC57質(zhì)粒的EcoRV酶切位點(diǎn)內(nèi)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，小量提取并測序，使用XbalI和BamHI雙酶切后電泳回收小片段，用作多重RTi-PCR檢測的陽性內(nèi)參DNA。用于擴(kuò)增陽性內(nèi)參的Taqman探針序列見表1。

表1 RTi-PCR引物與探針序列Fig.1 RTi-PCR primers&Taqman probes

1.7 多重RTi-PCR反應(yīng)

使用上述引物與探針對提取的細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行單重和多重RTi-PCR擴(kuò)增，并使用陽性內(nèi)參監(jiān)控反應(yīng)。將陽性內(nèi)參DNA用雙蒸水梯度稀釋，調(diào)整至擴(kuò)增曲線Ct值為35左右為實(shí)際使用濃度。20 μL多重RTi-PCR反應(yīng)體系包括：3組檢測引物與探針各500 nmol/L，陽性內(nèi)參探針500 nmol/L，陽性內(nèi)參DNA 1 μL，細(xì)菌基因組 DNA 1 μL，以及 10 μL Taqman Fast Universal PCR Master Mix（2×,ABI）?？焖贁U(kuò)增條件為：95℃20 s，及40個(gè)循環(huán)的95℃3s和60℃C 30 s。應(yīng)用ABI 7500 Software v2.0.1對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理，以Ct值小于35的擴(kuò)增作為致病菌檢測的陽性結(jié)果。

1.8 反應(yīng)特異性

將各42種標(biāo)準(zhǔn)菌株及自分離菌株（金黃色葡萄球菌8株、沙門氏菌11株、志賀氏菌10株，其他菌株15株）分別接種于2 mL牛奶，同時(shí)，隨機(jī)制備2種以上上述標(biāo)準(zhǔn)菌株同時(shí)污染的牛奶樣本21份，經(jīng)快速擴(kuò)增并提取細(xì)菌基因組DNA，使用上述多重RTi-PCR方法進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證方法的特異性。

1.9 檢測靈敏度

將預(yù)先經(jīng)培養(yǎng)、計(jì)數(shù)的3種目標(biāo)致病菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株分別10倍梯度稀釋后，提取細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行多重RTi-PCR檢測，以驗(yàn)證方法的靈敏度。同時(shí)，將目標(biāo)致病菌混合后梯度稀釋進(jìn)行檢測，以考察多重污染下靈敏度的變化。

1.10 模擬食品樣本檢測

我們分別使用牛奶、肉糜和土豆作為人工污染的食品樣本的載體。將經(jīng)計(jì)數(shù)的3種目標(biāo)致病菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株以單獨(dú)或隨機(jī)隨機(jī)組合的方式分別添加至2 mL牛奶、2 g肉糜或土豆勻漿中，共構(gòu)建人工污染的食品樣本112份，污染量為101cfu～102cfu。使用上述快速擴(kuò)增、DNA提取、多重RTi-PCR反應(yīng)的流程對食品樣本進(jìn)行目標(biāo)致病菌的檢測，并統(tǒng)計(jì)檢測結(jié)果，與實(shí)際污染狀況進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 食品中目標(biāo)致病菌的同時(shí)快速增菌與細(xì)菌基因組DNA提取

將3種目標(biāo)致病菌各1×101cfu同時(shí)于不同配比的GN/7.5%NaCl肉湯混合培養(yǎng)基中快速擴(kuò)增，并使用傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)。由表2中可見，當(dāng)混合培養(yǎng)基體積比為2:1時(shí)，可于6 h內(nèi)將3種致病菌同時(shí)擴(kuò)增至106cfu/mL；當(dāng)配比小于2:1時(shí)，金黃色葡萄球菌的擴(kuò)增占顯著優(yōu)勢，沙門氏菌和志賀氏菌生長受到抑制；當(dāng)配比大于2:1則反之。因此，為適應(yīng)同時(shí)定性檢測的需要，確定GN培養(yǎng)基和7.5%NaCl肉湯的體積比為2:1，37℃振搖培養(yǎng)6 h為食品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌同時(shí)快速增菌的最佳條件。

表2 快速共增菌后的細(xì)菌計(jì)數(shù)Table 2 Bacteria counting after rapid co-enrichment cfu/mL

分別使用Qiagen柱離心式細(xì)菌基因組快速提取試劑盒和溶菌酶-蛋白酶K法手工提取細(xì)菌基因組DNA測定濃度與純度表明，柱離心法提取后DNA濃度均達(dá) 0.5 μg/μL以上，且 OD260/OD280在 1.75～1.85之間；而手工抽提后溶于同樣體積的DNA濃度僅有約0.2 μg/μL 左右，OD260/OD280 在 1.85～1.90 之間。因此，使用Qiagen柱離心式細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒較溶菌酶-蛋白酶K法具有更高的提取效率，且DNA純度更高。通過提取10倍梯度稀釋的細(xì)菌培養(yǎng)物中的基因組DNA證明，當(dāng)細(xì)菌濃度在104～108之間時(shí)，使用進(jìn)口柱離心式試劑盒可使基因組DNA提取效率保持穩(wěn)定，且對G+和G-菌無明顯差異。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇Qiagen柱離心式試劑盒提取細(xì)菌的基因組DNA。

2.2 陽性內(nèi)參DNA的構(gòu)建和應(yīng)用

用于監(jiān)控多重RTi-PCR擴(kuò)增的陽性內(nèi)參DNA構(gòu)建流程見圖1。

重組質(zhì)粒PUC57-IPC經(jīng)測序，其序列與設(shè)計(jì)完全吻合。將雙酶切后回收的內(nèi)參小片段用雙蒸水梯度稀釋后分別加入多重RTi-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，選擇Ct值為35左右的稀釋度為實(shí)際使用的陽性內(nèi)參濃度。

構(gòu)建人PON1基因與志賀氏菌檢測的引物結(jié)合序列的重組基因，用作多重RTi-PCR的檢測內(nèi)參。以PON1基因片段（893－964）與志賀氏菌檢測引物結(jié)合序列的重組基因?yàn)閮?nèi)參的擴(kuò)增片段。

圖1 陽性內(nèi)參的構(gòu)建流程Fig.1 Recombination of internal positive control

2.3 多重RTi-PCR檢測特異性

將42種已知菌株快速擴(kuò)增后，分別使用單重和多重RTi-PCR方法對目標(biāo)致病菌進(jìn)行檢測。使用特異性引物/探針對相應(yīng)目標(biāo)致病菌進(jìn)行單重RTi-PCR反應(yīng)，均由相應(yīng)的報(bào)告基團(tuán)在35個(gè)循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線；使用混合引物/探針對42種已知菌株進(jìn)行多重RTi-PCR檢測，其檢測結(jié)果也與設(shè)計(jì)完全相符：3種目標(biāo)致病菌均由相應(yīng)報(bào)告基團(tuán)出現(xiàn)顯著擴(kuò)增，且未出現(xiàn)其他擴(kuò)增，對除目標(biāo)致病菌外的其他細(xì)菌的多重RTi-PCR檢測均未見任何擴(kuò)增。陽性內(nèi)參DNA在多重RTi-PCR體系中擴(kuò)增的Ct值均保持在35左右。對42種已知單菌株進(jìn)行多重RTi-PCR檢測的特異性考察結(jié)果見表3；對3種目標(biāo)致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株單重和多重RTi-PCR檢測的典型擴(kuò)增曲線見圖2。

同時(shí)，對隨機(jī)制備的2種以上已知標(biāo)準(zhǔn)菌株同時(shí)污染的樣本21份進(jìn)行多重RTi-PCR檢測也表明，不同目標(biāo)致病菌的基因組DNA未對檢測產(chǎn)生交叉干擾，不同組合的目標(biāo)致病菌均可被同時(shí)檢出，且未出現(xiàn)未預(yù)知的其他擴(kuò)增。

表3 多重RTi-PCR檢測的特異性考察Table 3 Single bacterial strains used for specificity assays of RTi-PCR reaction

圖2 目標(biāo)致病菌RTi-PCR檢測的典型擴(kuò)增曲線Fig.2 Typical RTi-PCR amplification plots for target pathogens

2.4 多重RTi-PCR檢測靈敏度

提取10倍梯度稀釋的目標(biāo)致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA，采用多重RTi-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增以確定檢測靈敏度。由圖3可見，當(dāng)3種致病菌的污染量從105cfu降低至103cfu時(shí)，均可在40個(gè)循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)顯著擴(kuò)增。一般認(rèn)為，當(dāng)Ct值小于35時(shí)可作出RTi-PCR的陽性判定。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)污染量為103cfu時(shí)，金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌擴(kuò)增曲線的Ct值分別為35.91、35.59和35.92。因此，本實(shí)驗(yàn)對3種目標(biāo)致病菌的檢測限均可達(dá)到103cfu。由于提取細(xì)菌基因組DNA后的溶解體積為100 μL，取1 μL進(jìn)行多重RTi-PCR反應(yīng)，因此本方法對3種目標(biāo)致病菌的檢測限均為101cfu/PCR反應(yīng)。同時(shí)，將目標(biāo)致病菌混合后梯度稀釋進(jìn)行多重RTi-PCR檢測表明，多重污染下檢測的靈敏度未發(fā)生變化。

圖3 多重RTi-PCR檢測的靈敏度考察Fig.3 Sensitivity of multiplex RTi-PCR reaction

2.5 模擬食品樣本檢測

我們將3種目標(biāo)致病菌已知菌株的不同組合人工污染食品樣本112份，應(yīng)用上述多重RTi-PCR方法進(jìn)行盲樣檢測。結(jié)果表明：無論載體為何種食品，使用上述快速共增菌、細(xì)菌基因組DNA提取、多重RTi-PCR檢測的流程對人為污染的3種目標(biāo)致病菌的檢出率均達(dá)到100%，未出現(xiàn)一例假陰性或假陽性。陽性內(nèi)參擴(kuò)增曲線的Ct值均保持在35左右，有效監(jiān)控了多重RTi-PCR的反應(yīng)體系。因此，本方法對食品中3種目標(biāo)致病菌的檢測具有良好的實(shí)用性。

3 結(jié)論

建立了3種常見的食源性致病菌金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的多重RTi-PCR檢測方法：首先探索目標(biāo)致病菌的快速共增菌策略，然后選擇高效的細(xì)菌基因組DNA提取方法，最后使用多重Taqman RTi-PCR進(jìn)行檢測，并構(gòu)建陽性內(nèi)參DNA監(jiān)控酶反應(yīng)體系。經(jīng)驗(yàn)證，方法具有良好的針對目標(biāo)致病菌的特異性，檢測限可達(dá)101cfu/PCR反應(yīng)。對百余份人工污染的食品盲樣進(jìn)行檢測均未出現(xiàn)假陽性和假陰性，檢測結(jié)果與實(shí)際污染狀況完全符合。

Taqman RTi-PCR是利用PCR反應(yīng)延伸過程中，DNA聚合酶使得Taqman探針的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而產(chǎn)生熒光強(qiáng)度變化從而衡量PCR產(chǎn)物的技術(shù)[11-13]。與使用SYBR green染料的RTi-PCR以及傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增加電泳檢測相比，使用Taqman探針確保了5’端引物結(jié)合模版下游序列的正確性，從而提升了反應(yīng)的特異性，有效地避免了前兩種方法易產(chǎn)生的假陽性結(jié)果，使檢測結(jié)果的可靠性大大提高[14]。利用單重或多重Taqman RTi-PCR技術(shù)對病原微生物的檢測研究已是食品微生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。實(shí)現(xiàn)了使用Taqman RTi-PCR技術(shù)對3種目標(biāo)致病菌的多重檢驗(yàn)，混合引物/探針在反應(yīng)體系內(nèi)均未見相互干擾，方法的特異性和靈敏度良好，為食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的快速檢驗(yàn)探索了新了途徑。

鑒于反應(yīng)體系的復(fù)雜性和酶反應(yīng)的不穩(wěn)定性，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了針對本實(shí)驗(yàn)的陽性內(nèi)參DNA對多重RTi-PCR進(jìn)行監(jiān)控[15-16]。內(nèi)參的擴(kuò)增片段結(jié)合了志賀氏菌RTi-PCR檢測的引物結(jié)合序列與人PON1基因的小片段，為原核基因與真菌來源的真核基因的重組基因，與食品中細(xì)菌基因組DNA的同源性很低，確保了其在多重RTi-PCR體系中的獨(dú)立性。同時(shí)，內(nèi)參利用志賀氏菌RTi-PCR檢測的引物進(jìn)行擴(kuò)增，與市售的陽性內(nèi)參相比，反應(yīng)體系中減少了一對內(nèi)參引物，降低了對多重RTi-PCR體系產(chǎn)生干擾的風(fēng)險(xiǎn)。在實(shí)際檢測中，陽性內(nèi)參均在Ct值35左右出現(xiàn)穩(wěn)定擴(kuò)增，從而有效保證了多重RTi-PCR檢測的可靠性。

下一步工作將在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，以不同類別的食品為載體，根據(jù)目標(biāo)致病菌梯度擴(kuò)增曲線的Ct值生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，對食品中的致病菌進(jìn)行單獨(dú)或同時(shí)快速定量研究，并結(jié)合傳統(tǒng)方法對定量結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，對標(biāo)準(zhǔn)曲線作出調(diào)整，以探索食品中致病菌RTi-PCR定量檢測的新方法。

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Multiplex Taqman RTi-PCR Based Platform for Simultaneous Detection of Three Food Borne Bacteria

ZHANG Chi,YANG Jun,LIU Xin-mei,WANG Xiao-li
（National Supervision＆Testing Centre for Agricultural＆Sidelin Product Quality，Nanjing Insititute of Supervision＆Testing on Product Quality，Nanjing 210028，Jiangsu,China）

Considerable attentions have focused on exploring fast and high-throughput method in food-borne pathogens detection using real-time quantitative PCR (RTi-PCR)techniques.In the present study,we first optimized conditions for simultaneous enrichment of Staphylococcus aureus,Salmonella spp.and Shigella spp.in food,and then selected a stable and efficient method to extract genomic DNA.Subsequently,a multiplex TaqMan RTi-PCR approach was settled for automatic detection,using FAM,TAMRA and CY5 fluorescently labeled specific probes aimed at the conserved genes of target pathogens,respectively.In addition,an internal positive control（IPC）was constructed to monitor the RTi-PCR reaction.Using a test panel of 42 target and nontarget bacterial strains and 21 samples of mixed bacteria,this multiplex RTi-PCR procedure was verified to be specific to the target bacteria without cross interference.The detection limit was 101cfu/PCR reaction for each pathogen.The IPC included in the reaction,ensuring the reliability of results,complies with quality management programmes.Finally,it was tested in artificially inoculated food,revealing a rapid,sensitive and accurate detection of the target bacteria.In summary,the assay represents an alternative approach for the qualitative detection of the cited bacterial species,suitable for a relatively inexpensive screening of food samples,reducing the turnaround time and the workload.

Staphylococcus aureus;Salmonella spp.;Shigella spp.;RTi-PCR;internal positive control

江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項(xiàng)目（KJ092115）

張馳（1978—），男（漢），工程師，博士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

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2010-08-26