何佳，吳延暉，張曼，許泓，林安清，張駿

（天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津 300458）

肉及肉制品中2，4－滴殘留量的測定

何佳，吳延暉，張曼，許泓，林安清，張駿

（天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津 300458）

在酸性條件下，以二氯甲烷提取肉組織中殘留的2，4－滴及其鈉鹽，并轉(zhuǎn)移至堿液中。用有機(jī)溶劑洗滌后在將其酸化，2，4－滴再用二氯甲烷提取。去除溶劑后用甲醇溶解定容，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。MS-MS采用電噴霧負(fù)離子化方式電離，多離子反應(yīng)監(jiān)測方式檢測。優(yōu)化了MS-MS參數(shù)和液相色譜條件，檢測限可達(dá)0.005 mg/kg，回收率、精密度、線性均滿足農(nóng)藥殘留分析的規(guī)定。

液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法；殘留分析；2,4-滴

2，4-滴 （2,4-Dicholrophenoxyacetic acid；2,4-D；CAS No.94-75-7），又名 2，4-二氯苯氧基乙酸，因其用量少、成本低而一直是世界主要除草劑品種之一，在30 mg/L以下低濃度時可作為植物生長調(diào)節(jié)劑。各個國家都對該藥作了嚴(yán)格的使用規(guī)定，國際農(nóng)藥殘留量法典會議對2，4-D提出的最大殘留限量：柑橘，2 mg/kg；谷類，0.2 mg/kg；小麥，0.5 mg/kg；蛋、肉、乳與乳制品，0.05 mg/kg。CAC和日本肯定列表規(guī)定2,4-D在各類商品中的最大殘留限量（MRL）為0.01 mg/kg～5.0 mg/kg。對于肉類，各國MRL規(guī)定均在0.05 mg/kg～0.3 mg/kg[1]。

本研究以二氯甲烷提取組織中殘留的2，4－滴及其鈉鹽，并轉(zhuǎn)移至堿液中。用有機(jī)溶劑洗滌后在將其酸化，2，4－滴再用二氯甲烷提取。去除溶劑后用甲醇溶解定容，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定[2]，電噴霧負(fù)離子化方式（ESI-）電離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）檢測模式，對被測樣品進(jìn)行定性、定量分析，并且方法的準(zhǔn)確度和靈敏度都滿足殘留測定的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HPLC-MS-MS聯(lián)用儀：1100-API 4000（Agilent-AB 公司，美國）；氮吹儀：N-EVAPTM 112（Organomation Associates公司，美國）。實驗室常規(guī)玻璃器具。

甲醇為色譜純，二氯甲烷，乙醇，無水乙醚，硫酸-水（1+9），氫氧化鈉溶液（30 g/L），氯化鈉，飽和氯化鈉溶液，水為超純水，0.22 μm針筒式微孔濾膜過濾器（有機(jī)相），2,4-D標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇配成濃度為1 mg/mL的儲備液，再稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液。

1.2 方法

1.2.1 提取和凈化

稱取混合均勻的試樣10 g（精確到0.01 g）于500 mL具塞錐形瓶中，加15 mL無水乙醇、5 mL硫酸-水（1+9）、10 g氯化鈉和100 mL二氯甲烷。加塞，振蕩提取30 min。通過快速濾紙過濾，濾液收集于250 mL分液漏斗中，用約50 mL二氯甲烷分3次洗滌錐形瓶及濾渣。合并洗液于分液漏斗中，于上述分液漏斗中加25 mL氫氧化鈉溶液和50 mL蒸餾水，再加入10 mL飽和氯化鈉溶液（此時水相pH應(yīng)大于12，否則應(yīng)補(bǔ)加適量氫氧化鈉溶液。對于極易乳化的樣品可再補(bǔ)加約3 g氯化鈉），振搖提取2 min。靜置分層，棄去二氯甲烷層。以25 mL二氯甲烷洗滌水層2次，棄去二氯甲烷層。再以25 mL無水乙醚洗滌水層，靜置分層，將下層水相轉(zhuǎn)移至另一500 mL分液漏斗中，棄去無水乙醚層。于上述水相中，加入25 mL硫酸-水（1+9）進(jìn)行酸化，搖勻[水相pH應(yīng)小于2，否則應(yīng)適量補(bǔ)加硫酸-水（1+9）]，然后分別用 50、25、25 mL 二氯甲烷提取水相。將二氯甲烷提取液收集于250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中。于50℃水浴中蒸干。用2 mL流動相溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.2 LC-MS/MS 條件

HPLC 條件：色譜柱為 Allure C18柱，100×2.1 mm，5 μm；流動相為甲醇-水（40+60，體積比）；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量 20 μL。

MS-MS條件：電離方式ESI－，離子源溫度450℃；氣簾氣壓力0.207 MPa；霧化氣壓力0.083 MPa；輔助氣1壓力0.276 MPa；輔助氣2壓力0.103 MPa；電噴霧電壓-4500 V；入口電壓-8 V；碰撞能量-16 V；碰撞室出口電壓-10 V。多反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM），監(jiān)測離子對（m/z）：定性離子對（218.6/160.9，220.8/162.9），定量離子對（218.6/160.9）。

1.2.3 測定

根據(jù)上述條件，以樣品空白提取液稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液作定量曲線，對被測樣品進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 線性

在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下，對一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01 μg/mL～1 μg/mL）進(jìn)行色譜測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對的面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=6.66×106x+5.48×104，相關(guān)系數(shù)為0.9997。

2.2 檢測限

2，4-D的測定低限是根據(jù)添加法進(jìn)行實測確定的，為5 μg/kg，可滿足各類進(jìn)出口肉及肉制品殘留限量檢驗的要求。以火腿罐頭為例，空白及添加檢測低限的譜圖見圖1與圖2。

圖1 空白火腿罐頭樣品中2，4-D的定量離子流圖Fig.1 Diagnostic ion chromatogram of 2，4-D in blank sample of canned pork ham

2.3 回收率與精密度

本方法采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，分別取空白的豬肉、雞肉和豬肉罐頭樣品，準(zhǔn)確加入2，4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別制備添加濃度為5、10、50 μg/kg的樣品各10份，對樣品進(jìn)行前處理，并進(jìn)行LC-MS/MS分析，計算回收率和精密度，結(jié)果得到所有農(nóng)藥的回收率均在60%～120%之間，精密度也均小于15%，回收率與精密度結(jié)果見表1和表2。

圖2 空白火腿罐頭添加檢測低限2，4-D的定量離子流圖Fig.2 Diagnostic ion chromatogram of 2，4-D in spiked sample of canned pork ham

表1 回收率實驗(n=6)Table 1 Test of recovery(n=6)

表2 精密度實驗(n=6)Table 2 Test of precision(n=6)

3 討論與結(jié)論

3.1 前處理方法的選擇及優(yōu)化

前處理方法上，參考美國《農(nóng)藥分析手冊》（PAM）和進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN 0195-1993[3]中的提取和凈化方法，把主要提取溶劑由三氯甲烷更換為二氯甲烷。兩者的提取效率接近，而二氯甲烷的毒性比三氯甲烷要低得多。

由于采用液質(zhì)質(zhì)方法檢測，就省卻了原方法的衍生化過程，改為溶解后直接進(jìn)樣，節(jié)省大量處理時間。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

因為2，4-D的準(zhǔn)分子離子[M-1]-經(jīng)二級碰撞后僅產(chǎn)生一個豐度較強(qiáng)的子離子（即Q3）（見圖3），這就要求每個化合物分別選擇兩個母離子（即Q1），才能滿足4個鑒別點的要求[4]。由于2,4-D分子含有2個Cl原子，利用Cl同位素的豐度比，選擇了[M+2-1]-作為另一個Q1，對Q1進(jìn)行二級碰撞，找到其對應(yīng)的Q3（圖4）。

3.3 結(jié)論

本研究建立的利用HPLC-MS-MS，ESI負(fù)離子化技術(shù)，以MRM方式檢測肉及肉制品中2,4-D殘留的方法，完全可以滿足肉及肉制品中的殘留限量要求，具有應(yīng)用價值。

圖3 MS2圖譜(218.6/160.9)Fig.3 Mass of 218.6/160.9

圖4 MS2圖譜(220.8/162.9)Fig.4 Mass of 220.8/162.9

[1]各國食品中農(nóng)藥獸藥殘留限量規(guī)定[M].大連：大連海事大學(xué)出版社,2002:8-156

[2]古瓏,許泓,林安清,等.液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法檢測坯布中殘留2,4-滴和 2,4-滴丙酸[J].現(xiàn)代儀器，2005(4)：52-55

[3]SN0195-93出口肉及肉制品中2,4-滴殘留量檢驗方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1993:1-5

[4]The European Commission.COMMISSION DECISION of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results[J].Official journal of the European Communities,2002,L221：8-36

Determination of 2，4-D Residues in Meat and Meat Products

HE Jia,WU Yan-hui,ZHANG Man,XU Hong,LIN An-qing,ZHANG Jun
（Tianjin Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300458，China）

The 2，4-D residues and its Na salts are extracted from the tissue with dichloromethane under acidified condition,then transferred into alkaline solution.The alkaline solution is washed with organic solvents and acidified,2，4-D is then reextracted with dichloromethane.After the dichloromethane evaporated,the residues is resolved by methanol and determined by Liquid chromatography-tandem mass spectrometry.The electrospray （ESI）negative mode detected by MRM is used for MS-MS.The optimization of analytical conditions of HPLC and analytical parameters of MS-MS are performed.The detection limit by this method is 0.005 mg/kg.The linearity,recovery rate and.precision meet the rules of the residue analysis of pesticides.

HPLC-MS-MS;residue analysis;2,4-D

何佳（1979—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品殘留分析。

2010-12-15