劉 宇，趙玉華

（哈爾濱體育學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150008）

細(xì)胞永生化技術(shù)在體育領(lǐng)域研究的可行性分析

劉 宇，趙玉華

（哈爾濱體育學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150008）

目前細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展，使優(yōu)秀運(yùn)動員細(xì)胞“永生化”成為可能。這在根本上解決了尋找抑制人類運(yùn)動能力基因研究的接力式進(jìn)行和標(biāo)本的暫時(shí)性的采集中存在的矛盾，介紹永生化技術(shù)在體育研究中的進(jìn)展，旨為在尋找和提高影響人類運(yùn)動能力基因方面提供可行性的研究方法。

永生化；細(xì)胞；體育

Abstract: Techniques of cell biology have been developing rapidly to date, rendering it possible to immortalize athletic cells. In addition, it radically solves the conflict between the intermittent search of determinant genes of human athletic potentials and the temporariness of sampling. This research introduces the latest progress of cell line immortalization in sports, serving the purpose of finding applicable investigation method of athletics related genes.

Key words: Immortalization; Cell; Athletics

CLC number: G804.21 Document code: A Article ID: 1008-2808(2011)01-0083-04

正常組織來源的體細(xì)胞在通常的體外培養(yǎng)條件下可生長和分裂,但經(jīng)過有限次的細(xì)胞傳代后,就會停止增殖,發(fā)生衰老和死亡。而生殖細(xì)胞、(胚胎)干細(xì)胞、部分腫瘤細(xì)胞和外源性基因轉(zhuǎn)染而構(gòu)建的永生化細(xì)胞則具有無限分裂和增殖的能力,是永生化細(xì)胞［1］。而能得到越秀運(yùn)動員的永生化細(xì)胞，就為我們研究人類自身限制運(yùn)動能力基因的連續(xù)性，提供了便利的條件。

1 永生細(xì)胞的機(jī)制

1.1 細(xì)胞的衰老

細(xì)胞經(jīng)多次分裂后,在腫瘤抑制因子p53和Rb作用下,細(xì)胞對生長因子等失去反應(yīng),產(chǎn)生DNA合成蛋白抑制因子,當(dāng)DNA不能完成修復(fù)時(shí)，細(xì)胞不可逆地停滯于G1期,發(fā)生衰老(senescence,M1期)。直到DNA完成修復(fù)，阻抑停止，細(xì)胞進(jìn)入S期；如果DNA損傷不能得到有效修復(fù)，則p53可能誘導(dǎo)編程性死亡。細(xì)胞再經(jīng)過20～30群體倍增次數(shù)(population doublings，PDs)后，進(jìn)入危機(jī)期(crisis,M2期),細(xì)胞出現(xiàn)退化,凋亡或者死亡。只有少數(shù)細(xì)胞在一定因素的影響下，端粒酶被激活，以自身RNA為模板合成端粒DNA來補(bǔ)充或延長端粒，恢復(fù)染色體的穩(wěn)定性，從而使細(xì)胞越過危機(jī)期，發(fā)生了永生化［1-4］。

1.2 細(xì)胞永生化

一般認(rèn)為永生化是體外培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過自發(fā)的或外界因素的影響而從增殖危機(jī)中逃逸,從而具有無限增殖能力的過程。基本原理是通過基因轉(zhuǎn)染技等技術(shù)，將外源性的永生相關(guān)基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的目的細(xì)胞，或誘導(dǎo)衰老相關(guān)基因突變，以增加永生化的發(fā)生概率。被普遍接受的永生化機(jī)理是M1-M2理論:細(xì)胞經(jīng)多次分裂后,在腫瘤抑制因子p53和Rb作用下,細(xì)胞進(jìn)入M1期,開始衰老,但不一定死亡。而病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等則可以抑制M1期機(jī)制,細(xì)胞繞過M1期繼續(xù)生長。細(xì)胞經(jīng)過20～30次的群體倍增后,進(jìn)入M2期,細(xì)胞出現(xiàn)退化,絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡,只有罕見的細(xì)胞在一些因素影響下,端粒酶被激活,以它自身RNA為模板不斷合成端粒DNA來補(bǔ)充和延長端粒有限長度,以維持端粒長度,恢復(fù)染色體的穩(wěn)定性使細(xì)胞得以逾越M2期,獲得無限分裂和增殖的能力,細(xì)胞發(fā)生永生化［5］。細(xì)胞自發(fā)性永生化的幾率非常小,嚙齒類動物細(xì)胞為10-5～ 10-6,而人類細(xì)胞則更罕見,小于10-12［6］。因此,保存優(yōu)秀運(yùn)動員細(xì)胞，尋找影響人類運(yùn)動能力基因就有必要借助細(xì)胞永生化技術(shù)。學(xué)者們通過基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞內(nèi),以增加永生化的發(fā)生幾率,進(jìn)而建立永生化細(xì)胞系。

2 細(xì)胞永生化技術(shù)的應(yīng)用

細(xì)胞永生化技術(shù)發(fā)展到今天已有了長足的進(jìn)步，EB病毒、SV40病毒都是永生化細(xì)胞常用的轉(zhuǎn)化病毒，而如乳頭瘤病毒E6、乙型肝炎病毒(HBV) 雖不是使細(xì)胞永生的常用病毒,但它們可以使一些特殊細(xì)胞的增殖能力加強(qiáng)。

2.1 細(xì)胞永生化技術(shù)在醫(yī)學(xué)遺傳領(lǐng)域的應(yīng)用

楊靜［7］等借助EB病毒和TPA的體外協(xié)同作用，采用相差顯微攝影、間接免疫熒光等方法對12例EB病毒感染的原代人胚鼻咽上皮細(xì)胞生長過程進(jìn)行了觀察，針對我國南方地區(qū)高發(fā)的惡性腫瘤，鼻咽癌，建立了一個(gè)良好的體外多階段細(xì)胞模型，為能徹底闡明鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。潘小平［8］等指出肝組織細(xì)胞永生化技術(shù)不僅能為肝組織細(xì)胞生物學(xué)的研究提供性狀穩(wěn)定的研究對象,還為生物型人工肝、細(xì)胞移植等研究提供了一種可靠的潛在細(xì)胞源。柯朝陽［9］等應(yīng)用含有HPV16 DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常人喉上皮細(xì)胞,試圖建立永生化人喉上皮細(xì)胞系并確證HPV與喉癌的發(fā)生有無因果關(guān)系。其永生化細(xì)胞人喉上皮細(xì)胞系的建立為研究人口腔、食管、支氣管、子宮頸等部位腫瘤提供了良好的體外模型。褚嘉祐［10］等承擔(dān)中國不同民族基因組的保存與遺傳多樣性研究，中國不同民族永生細(xì)胞庫系統(tǒng)地收集了中國42個(gè)民族的58個(gè)群體的血樣標(biāo)本，建立了包含3119株永生細(xì)胞株庫和6010余例個(gè)體的DNA庫，永久性保存，解決中華民族基因組保存問題，供今后永久性研究。在中華民族基因組保存和遺傳多樣性研究的基礎(chǔ)上，涉及疾病，特別是不同群體發(fā)病率有較大差異的疾病基因研究將可能得到突破。

2.2 可應(yīng)用于體育的永生化技術(shù)

在眾多轉(zhuǎn)化體外細(xì)胞使其永生化的方法中，我們常以采集樣本方便，病毒轉(zhuǎn)化永生化細(xì)胞率高，操作周期短的EB病毒轉(zhuǎn)化外周血B淋巴細(xì)胞建立永生細(xì)胞系［11］，為保存優(yōu)秀運(yùn)動員基因，研究影響運(yùn)動能力基因的最合適方法。

EB病毒是愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr）的簡稱。是在非洲伯基特淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的一種皰疹病毒，屬皰疹病毒科。EB病毒具有嗜B淋巴細(xì)胞的特性，可以在體外直接感染人類外周血淋巴細(xì)胞，刺激多克隆免疫球蛋白分泌。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室,B95-8細(xì)胞系已成為EB病毒的主要來源。人類和部分靈長類動物的成熟B淋巴細(xì)胞上具有EB病毒的受體，所以為EB病毒感染B淋巴細(xì)胞已達(dá)到無限生殖提供條件。有關(guān)EB病毒轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞的機(jī)制研究認(rèn)為,EB病毒首先通過病毒外膜蛋白gp350/220與B淋巴細(xì)胞表面補(bǔ)體C3d的受體CR2（complement receptor type 2,CR2）結(jié)合,由于CR2是補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)劑家族中唯一能在成熟的B淋巴細(xì)胞上表達(dá)的成員，所以表達(dá)CR2的B淋巴細(xì)胞，EB病毒通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入其內(nèi)部。EB病毒內(nèi)嵌進(jìn)入細(xì)胞后，形成一個(gè)蛋白覆蓋的液泡，不需要溶酶體的作用，病毒可自行脫包膜，伺候EB病毒核衣殼體直接與液泡膜融合進(jìn)入胞質(zhì)、胞核［12］。進(jìn)入宿主細(xì)胞后，EB病毒脫去衣殼，末端重復(fù)序列融合，病毒基因組環(huán)化以多拷貝型質(zhì)粒的形式保存。病毒基因組編碼的EBNALP、1、2、3A、3C和LMP1對維持細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是必需的,其中EBNA2、3C和LMP1直接誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞在正常活化途徑中所需基因的表達(dá)［13-16］。EB病毒永生化的B細(xì)胞的一個(gè)最顯著的特點(diǎn)就是端粒酶活性的提高,這可能是導(dǎo)致B細(xì)胞永生的主要原因。EB病毒轉(zhuǎn)化外周血B淋巴細(xì)胞,使其成為一種能連續(xù)分裂永久生存的類淋巴母細(xì)胞,由此建立的類淋巴母細(xì)胞株即為永生細(xì)胞株, 其端粒酶活性提高，維護(hù)了細(xì)胞染色體端粒長度的穩(wěn)定，并能夠不斷分裂增殖，從而促使B淋巴細(xì)胞的永生性生長，它可永遠(yuǎn)的進(jìn)行傳代,并且每一種永生細(xì)胞株保存了原來提供血樣個(gè)體的完整基因組,而且它的生化和分子生物學(xué)特性不發(fā)生變化［17-20］，所以可作為優(yōu)秀運(yùn)動員基因庫建立的首選方法。

運(yùn)用細(xì)胞永生化技術(shù)建立運(yùn)動員基因庫鮮有報(bào)道，但我國優(yōu)秀運(yùn)動員的基因庫建設(shè)已開始進(jìn)行。2006年，由上海市科委資助，上海體育科研所承擔(dān)的“上海優(yōu)秀運(yùn)動員基因庫的初步建立及身體素質(zhì)相關(guān)基因的研究”課題結(jié)題，建立起上海及中國部分重點(diǎn)耐力性項(xiàng)目優(yōu)秀運(yùn)動員基因庫［21］。2007年，臺灣體育學(xué)院的一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)建立“運(yùn)動高手基因庫”，其中包括跆拳道，棒球兩個(gè)項(xiàng)目的優(yōu)秀運(yùn)動員，用唾液采樣的方式取得杰出運(yùn)動員的基因，進(jìn)一步分析其特殊基因模式，并認(rèn)為日后可作為選才的依據(jù)［22］。2008年“國家計(jì)劃生育委員會科學(xué)技術(shù)研究所”里，建立了由中國科學(xué)家獨(dú)立操作的“中國人遺傳資源庫”，其中共有20個(gè)資源類型，已經(jīng)采集24萬份生物信息樣本。比起“腫瘤”、“人體組織器官”這樣的資源庫，“優(yōu)秀運(yùn)動員”的資源庫很小，目前只有血液樣本390份。但這個(gè)資源庫卻因?yàn)橐呀?jīng)采集了劉翔、姚明這樣著名的運(yùn)動員的遺傳信息而備受關(guān)注［23］。目前湖南等幾家地方體科所正聯(lián)合北京體育大學(xué)，籌建優(yōu)秀舉重運(yùn)動員基因庫，龍清泉等國際健將都將列入研究對象［24］。

3 細(xì)胞永生化技術(shù)在體育中的應(yīng)用前景

EB病毒轉(zhuǎn)化優(yōu)秀運(yùn)動員外周血B淋巴細(xì)胞建立的永生細(xì)胞株讓原本有一定壽命的人體細(xì)胞能夠不間斷地繁殖下去，使各個(gè)領(lǐng)域優(yōu)秀運(yùn)動員的基因得以永久的保存。永生細(xì)胞株的建立不但能夠永久保存相關(guān)個(gè)體的基因，而且由于可以為研究各運(yùn)動項(xiàng)群基因結(jié)構(gòu)差別、探討各運(yùn)動項(xiàng)群的共同點(diǎn)及之間差別、探索重要抑制運(yùn)動能力基因在各運(yùn)動項(xiàng)群中分布特征及遺傳學(xué)意義、建立一系列與耐力、力量、速度性相關(guān)的項(xiàng)群體系細(xì)胞庫、基因探針、基因興奮劑等諸多體育科研領(lǐng)域提供源源不斷的細(xì)胞和DNA，所以在體育科學(xué)研究中建立優(yōu)秀運(yùn)動員的永生細(xì)胞庫必將得到越來越多的重視。永生細(xì)胞株在轉(zhuǎn)化前后其細(xì)胞和分子遺傳學(xué)是穩(wěn)定的，但細(xì)胞株在長期傳代的過程中遺傳特征是否發(fā)生改變，是一個(gè)關(guān)系著科學(xué)研究中實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要問題，也是我們繼續(xù)研究的方向［25］。

4 結(jié)束語

尋找影響和限制人類運(yùn)動能力的基因需要長時(shí)間的探索與研究。但是，在傳統(tǒng)的方法中，研究的接力式進(jìn)行和標(biāo)本的暫時(shí)性的采集中存在的矛盾很難調(diào)和，所以將優(yōu)秀運(yùn)動員的基因進(jìn)行細(xì)胞永生化，可有效的對同一研究對象進(jìn)行持久的連續(xù)性的研究。細(xì)胞永生化技術(shù)這不僅僅將運(yùn)動遺傳資源得到有效地保存，也是為進(jìn)一步影響運(yùn)動能力基因的尋找與開發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，更是為青少年兒童的運(yùn)動選材、優(yōu)秀運(yùn)動員及后備人才的選拔提供了現(xiàn)實(shí)依據(jù)。

［1］楊彥春,賈 駿.細(xì)胞衰老和永生化［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2002, 25 (6): 568-570.

［2］Denis H, Lacroix JC. The dichotomy between germ lineand somatic line, and the origin of cell mortalit［J］. TrendsGenet, 1993, 9 (1): 7-11.

［3］Lundberg AS, Hahn WC, Gupta P, et al. Genes involvedin senescence and immortalization［J］. Current Opinion in Cell Biology, 2000, 12: 705-709.

［4］楊娜娜,王 娟.細(xì)胞永生化的研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī), 2004, 32 (1): 37-39.

［5］Shay JW, Wright WE, Werbin H. Defining the molecularmechanisms of human cell immortalization［J］. BiochimBiophys Acta, 1991, 1072 (1): 1-7.

［6］Shay JW, Van Der Haegen BA, Ying Y, et al. The frequency of immortalization of human fibroblasts and mammary epithelial cells transfected with SV40 large T-antigen［J］. Exp Cell Res, 1993, 209 (1): 45.

［7］楊 靜,唐發(fā)清.EB病毒介導(dǎo)的鼻咽上皮細(xì)胞永生化早期階段的生物學(xué)觀察［J］.中國病理生理雜志, 2000, 16 (10): 1033.

［8］潘小平,李蘭娟. 肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的永生化研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)·流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊, 2005, 32 (6): 344-349.

［9］柯朝陽,吳展元.人乳頭狀瘤病毒16型DNA誘導(dǎo)的永生化人喉上皮細(xì)胞系的建立［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2006, 4 (2): 139-141.

［10］褚嘉祐,徐玖瑾.中國不同民族永生細(xì)胞庫的建立和中華民族遺傳多樣性的研究.［Z］國家科技成果, 2006.

［11］王新文.人類細(xì)胞永生化的研究進(jìn)展［J］牙體牙髓牙周病學(xué)雜志, 2003, 13 (4): 233-236.

［12］JagerM, PrangN, MittererM, et al. Pathogenesis of chronic Epstein-Barr virus infection: detection of a virus strain with a high rate of lytic replication［J］. Br J Haematol, 1996, 95 (4): 626.

［13］Maruo S, Yang L, Takada K.［J］. J Gen Virol, 2001, 82 (Pt10): 2373-2383.

［14］Martin DR, Marlowe RL, Ahearn JM.［J］. J Virol, 1994, 68 (8): 4716-4726.

［15］Kurth J, Spieker T, Wustrow J, et al.［J］. Immunity, 2000, 13 (4): 485-495.

［16］王平忠. EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞系的建立及應(yīng)用［J］. 國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊, 2003, 26 (6): 292-295.

［17］褚嘉祐.中華民族永生細(xì)胞庫的建立［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2009: 9-12.

［18］Steube KG, Gignac SM, Hu ZB, et al. In vitro culture studies of childhood myelodysplastic syndrome: establishment of the cell line MUTZ-1. Leuk-Lymphoma, 1997, 25 (3-4): 345-363.

［19］Neitzel H. A routine method of the estab1ishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines. Hum Genet, 1986, 73: 320-326.

［20］劉敏娟. EBV體外轉(zhuǎn)染人B淋巴細(xì)胞方法的優(yōu)化及B淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系的體外建立［D］.蘇州:蘇州大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2009.

［21］郭紅生.上海年鑒2007［EB/OL］. http://www. shtong.gov.cn/node2/node19828/node78865/ node78909/node79007/userobject1ai100128. html, 2006.

［22］聯(lián)合早報(bào).臺灣建“運(yùn)動高手基因庫”［EB/OL］. http://www.zaobao.com/special/china/taiwan/ pages10/taiwan070327b.html, 2007-03-27.

［23］劉念龍.超級體能,與生俱來［EB/OL］.http:// ngmchina.com.cn/web/?action-viewnewsitemid-17745, 2009-01-17.

［24］紅網(wǎng)-三湘都市報(bào).北體大將建運(yùn)動員基因庫,基因角度分析奧運(yùn)冠軍［EB/OL］. http://sports.runsky.com/2009-12/16/ content_3448521.htm, 2009-12-16.

［25］李 麗,趙玉華. 遺傳因素在速度滑冰運(yùn)動員選材中的應(yīng)用［J］.哈爾濱體育學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, (5): 20-22.

The Feasibility Analysis of Cell Line Immortalization in Athletics

LIU Yu, ZHAO Yu-hua
(Harbin Institute of Physical Education, Harbin 150008, HeilongJiang China)

G804.21

A

1008-2808(2011)01-0083-04

2010-08-29；

2010-09-26

劉 宇（1985－），男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)轶w育運(yùn)動中競技能力的開發(fā)與評定。