劉彬果，張新萍，劉 巖

(中國人民解放軍第254醫(yī)院藥劑科，天津 300142)

銀杏葉中萜內(nèi)酯類化合物的研究進展

劉彬果，張新萍，劉 巖

(中國人民解放軍第254醫(yī)院藥劑科，天津 300142)

銀杏萜內(nèi)酯是銀杏葉提取物及其制劑中的主要活性成分，是公認的血小板激活因子拮抗劑，被廣泛用于心腦血管疾病。本文對銀杏葉中萜內(nèi)酯類化合物的化學成分、提取分離、含量檢測及藥理作用方面的研究進展進行了綜述，并對其研究前景進行了展望。

銀杏葉萜內(nèi)酯；化學成分；提取；血小板活化因子

銀杏(GinkgobilobaL.)又名白果，是我國的古老樹種，是中華民族悠久歷史、古老人文的象征。隨著對其有效成分認識的逐步深化，作為銀杏葉中主要活性成分的萜內(nèi)酯的研究越來越受到重視。銀杏萜內(nèi)酯是血小板活化因子(PAF) 的強拮抗劑，對于心腦血管疾病具有顯著的療效。本文綜述了銀杏葉中萜內(nèi)酯類化合物在化學成分、提取分離、含量檢測及藥理作用方面的研究進展。

1 銀杏萜內(nèi)酯的化學成分

銀杏中的萜類主要是倍半萜和二萜。它們是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一的擁有叔丁基官能團的天然物質(zhì)。銀杏內(nèi)酯(ginkgilides)屬二萜類化合物，白果內(nèi)酯(bilobalide)屬倍半萜內(nèi)酯。銀杏內(nèi)酯分子具有獨特的十二碳骨架結(jié)構(gòu)，嵌有1個叔丁基和6個五元環(huán)。包括1個螺[4,4]壬烷，1個四氫呋喃環(huán)和3個內(nèi)酯環(huán)。不同銀杏內(nèi)酯間的差異僅是羥基數(shù)目和位置不同，即R1、R2、R3位置是OH還是H排列的差別。銀杏內(nèi)酯有7種，用A、B、C、M、J、K、L命名。銀杏內(nèi)酯目前被認為是最有臨床應用前景的天然PAF受體拮抗劑，其拮抗作用活性與化學結(jié)構(gòu)密切相關，當內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中R3為羥基或羥基數(shù)目增多時，對PAF的拮抗活性減弱；當R2為羥基且R3為H時，則活性顯著增強，其中以銀杏內(nèi)酯B對PAF產(chǎn)生的拮抗作用最強，迄今對銀杏內(nèi)酯B的藥理作用研究也最集中。白果內(nèi)酯是目前從銀杏葉中發(fā)現(xiàn)的唯一的一個倍半萜內(nèi)酯化合物，它是由15個碳原子組成，一般被列為倍半萜，實際上是銀杏內(nèi)酯類的環(huán)氧化開裂降解產(chǎn)物。

2 銀杏葉萜內(nèi)酯的提取分離方法

銀杏葉中萜內(nèi)酯的含量極低,要得到具有高藥用價值的銀杏萜內(nèi)酯必須將銀杏葉或其粗提物進行提取。目前文獻報道的銀杏萜內(nèi)酯的提取方法主要有:溶劑萃取法、溶劑萃取-柱層析法及超臨界流體提取法。

2.1溶劑萃取法 該法是國內(nèi)外采用最廣泛的方法。銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯易溶于極性、中等極性的溶劑中，如低濃度的乙醇、THF、丙酮和乙酸乙酯。能溶于乙醚、水和其他的非極性溶劑，如氯仿、甲苯和己烷等[1]。目前常采用一定比例的甲醇水溶液提取或采用乙酸乙酯萃取。張立國等[2]考察了黃酮和萜內(nèi)酯在不同溶劑不同溫度下的溶解性，結(jié)果表明：萜內(nèi)酯在70 ℃，溶劑強度為8.50處溶解度最大。王成章等[3]比較了幾種溶劑對銀杏的浸提效果，認為25%乙醇水溶液的效果最好，該方法提取獲得的銀杏總內(nèi)酯為 35%～40%。

2.2溶劑萃取-柱層析法 溶劑萃取-柱層析法可以很好的凈化銀杏粗提物，使其滿足后期分離檢測工作的要求。該法成本低、回收率高，有機溶劑殘留少。何君等[4]采用DA201型大孔吸附樹脂分離銀杏葉提取物中銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯，乙醇水溶液梯度洗脫,乙醇水重結(jié)晶得到萜內(nèi)酯4種單體,其純度達到95%以上。韓亞蓉等[5]探討了通過丙酮,乙酸乙酯與乙醇三級溶解銀杏提取物,每一級溶解液匹配合適的柱層析吸附劑與洗脫液,從而達到分離純化銀杏內(nèi)酯的目的。

2.3超臨界流體提取法 超臨界流體提取是一種新型的提取技術。主要通過控制溫度、壓力及加入改性劑等方法達到分離純化的目的。鄧啟煥等[6]以銀杏葉有效成分分離為對象,建立了一套超臨界流體小試、中試裝置和實驗方法,所得提取物中銀杏黃酮含量為28%,銀杏內(nèi)酯含量為7.2%。均高于國際現(xiàn)行公認的質(zhì)量標準。該法與溶劑法相比，具有提取效率高、無溶劑殘留、活性成分和熱不穩(wěn)定成分不易被破壞等優(yōu)點。運用超臨界CO2提取銀杏葉中萜內(nèi)酯具有廣泛的發(fā)展前景。但由于多數(shù)企業(yè)及科研機構(gòu)沒有超臨界提取設備，應用受到限制，而且該法不適合常規(guī)質(zhì)量控制檢測。

3 銀杏葉萜內(nèi)酯的分析方法

銀杏葉萜內(nèi)酯的含量是銀杏葉及其制劑質(zhì)量控制的關鍵指標，國內(nèi)外有關萜內(nèi)酯的分析方法報道較多，主要有以下幾種：

3.1高效液相色譜法(HPLC) HPLC儀在定量監(jiān)測實驗室常見，且該方法可以在15 min內(nèi)有效地分析銀杏內(nèi)酯的5種成分，達到足夠的靈敏度，因而HPLC法是分離銀杏內(nèi)酯應用最廣泛的方法。常采用RP C18柱，溶劑是甲醇和THF，恒溶劑成分洗脫法(等度)即可達到分離分析目的，只有當黃酮醇苷和銀杏內(nèi)酯同時需要分析時才采用梯度洗脫法[7]。由于檢測器的不同，HPLC法又分為HPLC-示差折光檢測器(RI)、HPLC-UV、HPLC-蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)、HPLC-質(zhì)譜(MS)等方法。

紫外檢測器是HPLC最常用的檢測器，但是銀杏內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中沒有共軛，酯的特征吸收峰(220 nm)很弱，同時由于大量的黃酮等強吸收酚性物質(zhì)干擾，定量分析比較困難，因而，HPLC法多采用RI檢測。RI法的總響應值比UV法高100多倍，但RI檢測的預凈化處理費時費力,不能快速檢測,且穩(wěn)定性相對較差,靈敏度不高,要求流動相組成在整個洗脫過程中保持相同?，F(xiàn)在應用較多的是蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)，銀杏萜內(nèi)酯是非揮發(fā)性物質(zhì), HPLC-ELSD檢測萜內(nèi)酯是非常適合的,溶劑在檢測器中全蒸發(fā),不干擾檢測；靈敏度及穩(wěn)定性也較好,與THF和組分有很好的相容性，從而降低了對樣品的預凈化要求；采用梯度洗脫可得到較好的色譜分離效果，其缺點是線性關系較差，每次均須調(diào)整參數(shù)。隨著近年來LC/MS的廣泛應用，該方法越來越多用于銀杏內(nèi)酯的分析。該方法提高了分析靈敏度,可測定微量銀杏內(nèi)酯，可在較大范圍內(nèi)保持較好的線性關系,滿足分析需要，但其響應是非線性應答,價格昂貴。

3.2氣相色譜法(GC法) 氣相色譜法也是一個很好的分離分析萜內(nèi)酯類化合物的方法，然而，在分析前需要甲基硅烷化。甲基硅烷化后的樣品可以直接進樣，靈敏度和重現(xiàn)性可達到定量分析的要求。分離最好的是長30 m內(nèi)壁涂有100%二甲基-聚硅氧烷的毛細管柱。Gogo等[8]報道了5種銀杏內(nèi)酯的保留時間。劉紅梅等[9]對銀杏葉提取物中銀杏萜內(nèi)酯的毛細管柱氣相色譜分離條件作了試驗，并采用內(nèi)標法測定了各組分的含量，該方法重現(xiàn)性、準確度良好。冷平生等[10]用20%的甲醇水溶液提取銀杏葉中的銀杏內(nèi)酯A、B和白果內(nèi)酯,用硅膠柱純化,甲苯與丙酮混合液洗脫,經(jīng)硅烷化后質(zhì)譜定性,氣相色譜定量。該方法對白果內(nèi)酯與銀杏內(nèi)酯A、B的回收率分別為93.01%、96.32%、94.68%,相對變異系數(shù)分別為5.75%、3.88%、4.23%。廖詠玲等[11]采用20%的甲醇水溶液提取銀杏葉,提取物溶于10%NaH2PO4溶液中,EOA/THF一步純化,衍生后采用大口徑毛細管氣相色譜分離和測定了銀杏葉萜內(nèi)酯，樣品在16 min內(nèi)完全分離。該方法簡便、靈敏、準確、重現(xiàn)性好，優(yōu)于硅膠柱層析法。

3.3薄層色譜法(TLC法) 應用HPLC法存在樣品前處理繁復、成本高、測定周期長、檢測器要求高等缺點，近年來學者探討采用薄層掃描法。Van Beek[12]用TLC分析銀杏葉中白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯(A、B、C、J),檢測靈敏度為1 μg,條件為醋酸鈉浸漬的硅膠(F254)板,展開劑為乙酸乙酯:正己烷=9:1,0.06≤ΔRf≤0.17,醋酸鈉能改善內(nèi)酯A、B和內(nèi)酯J、C的分離,提高醋酐的顯色效果。顏玉貞等[13]采用硅膠板層析，展畢用醋酐蒸汽熏30 min，再于160 ℃加熱30 min后用熒光掃描。銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯的最低檢測限分別為0.12、0.22、0.25及0.35 μg，RSD為2%～3.7%,回收率95.3%～98.8%。較HPLC法RI檢測器提高10倍，分析時效比提高6倍以上。唐于平等[14]用薄層掃描法測定銀杏提取物制劑內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯的含量，樣品經(jīng)硅膠GF254板展開后，150 ℃烘40 min，雙波長掃描，λS=370 nm，λR=300 nm，精密度RSD為2%～4%，回收率99%左右。陸涌[15]測定了銀杏浸膏中白果內(nèi)酯的含量，方法簡便易行，精密度高，回收率好，線性范圍寬。

4 銀杏葉萜內(nèi)酯藥理作用研究

4.1 對中樞神經(jīng)的保護作用 銀杏內(nèi)酯能明顯改善腦缺血狀態(tài)，對缺血引起的腦水腫、電解質(zhì)紊亂、炎性細胞浸潤、血小板聚集均有顯著抑制作用。大量研究表明，銀杏內(nèi)酯對大鼠短暫性及永久性局灶性大腦中動脈阻塞模型及小鼠不完全性腦缺血模型均具有保護作用[16]。其神經(jīng)保護機制主要有以下幾個方面：①清除自由基、抗氧化。神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能的完成需要大量的氧，也極易遭受自由基氧化損傷。銀杏內(nèi)酯正是氧自由基的捕捉劑和清除劑。銀杏內(nèi)酯還通過提高肝細胞色素P450酶系統(tǒng)，線粒體編碼的環(huán)氧化酶的表達來減少氧自由基的形成和超氧離子的釋放，從而發(fā)揮間接抗氧化作用。銀杏內(nèi)酯可以降低大鼠局灶性腦缺血模型腦組織乳酸(LA)、丙二醛(MDA)水平，降低腦脂質(zhì)過氧化速率，同時升高SOD，還原型谷光甘肽(GSH)的水平，加快對組織超氧陰離子的清除[17]。②抑制谷氨酸毒性。L-Glu可使培養(yǎng)的大鼠小腦神經(jīng)元大量死亡，而預先加入銀杏內(nèi)酯或銀杏葉提取物可明顯降低Glu的毒性[17]。徐靜等利用原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的谷氨酸興奮毒性模型,經(jīng)預處理給藥模式觀察了對神經(jīng)元損傷的影響,發(fā)現(xiàn)通過預處理給藥均能明顯提高細胞的存活率,降低凋亡率,減少泄露率, 對谷氨酸興奮毒性具有保護作用[19]。③抑制體內(nèi)活性介質(zhì)一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。NO是機體內(nèi)源性活性介質(zhì)，同時也是一種內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)。過量的NO的產(chǎn)生和釋放，可以通過自由基或其他途徑產(chǎn)生神經(jīng)毒性，參與多種組織和細胞的凋亡過程。銀杏內(nèi)酯A、B可以抑制大鼠C6及人BT325膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生NO。彭珊瑛等[20]研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B可顯著抑制 LPS 刺激的大鼠原代星形膠質(zhì)細胞的 NO過量生成。銀杏內(nèi)酯呈時間-劑量依賴性地抑制脂多糖、TNF-α、IL-1及IL-2誘導星狀細胞瘤及人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH的NO的產(chǎn)生，從而抑制其毒性作用，實現(xiàn)對神經(jīng)的保護作用[21]。

4.2對心血管系統(tǒng)的影響 血管平滑肌細胞(VSMC)遷移和過度增殖是高血壓、動脈粥樣硬化及血管成形術后再狹窄等血管增生性疾病的基本特征。銀杏內(nèi)酯B(GKB)可預防動脈粥樣硬化斑的形成,減少心血管事件的發(fā)生。研究證實[22], GKB與GKA和GKB的混合物均呈濃度依賴性地抑制SMC的增殖。陸曉茜等[23]選用動脈粥樣硬化斑塊形成的早期危險因素弱氧化修飾低密度脂蛋白作為刺激因子作用于體外培養(yǎng)的ECV304細胞,發(fā)現(xiàn)抗氧化劑GKB,可部分抑制mmLDL誘導的細胞內(nèi)鈣超載,在細胞的氧化損傷中具有一定保護作用。GKB可對抗心肌缺血所引起的心肌電生理的變化,從而改善心肌缺氧狀態(tài)、預防心肌缺血所致的心律失常的發(fā)生。在冠狀動脈結(jié)扎的大鼠實驗中，于觀察期內(nèi)發(fā)現(xiàn),BN-52021(銀杏內(nèi)酯B)可極大縮減心肌梗死的范圍。尹艷艷等[24]發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯能增加冠狀動脈前降支結(jié)扎犬的心輸出量、每搏輸出量和左心室最大收縮速率,降低總外周阻力,提高左心室做功指數(shù)和每搏功,提示其增強心肌損傷時的收縮力,改善急性心肌梗死時心臟的泵血功能的作用。采用正常及異丙腎上腺素誘導心肌缺血小鼠常壓耐缺氧實驗發(fā)現(xiàn)[25]，銀杏內(nèi)酯可以延長正常小鼠和心肌缺血小鼠常壓耐缺氧條件下的存活時間，可以減少血清含量及降低血清活力，可降低血清CK活力，提高SOD活力和減少MDA含量，可降低心肌含水量，保護心肌缺血損傷，該作用可能與穩(wěn)定心肌細胞膜、減少心肌酶的漏出和抗氧自由基有關。

4.3對消化系統(tǒng)的作用 銀杏內(nèi)酯具有調(diào)節(jié)胃腸活動等作用。銀杏內(nèi)酯B能顯著改善PAF的內(nèi)毒素所致的鼠胃、腸潰瘍，并能部分抑制乙醇對胃的損傷。鼠慢性結(jié)腸炎誘發(fā)后，結(jié)腸內(nèi)給予銀杏內(nèi)酯B或5-氨基水楊酸對結(jié)腸損傷無影響，但腹腔給予銀杏內(nèi)酯B后減少了粘連和腹瀉的發(fā)病率。采用束縛-水浸復制大鼠應激性潰瘍模型，銀杏內(nèi)酯A預處理組潰瘍指數(shù)明顯下降[26]，顯示銀杏內(nèi)酯A對應激性潰瘍有顯著的預防作用。銀杏內(nèi)酯A對內(nèi)毒素所致家兔小腸運動功能損害具有保護作用[27]。觀察局部缺血損傷后鼠腸的通透性、溶酶體酶的釋放及回腸中丙二酸二醛含量的變化，銀杏內(nèi)酯B不影響脊髓過氧化酶活性，但抑制丙二酸二醛的形成、黏膜滲透性增加和N-乙酰-β葡萄糖胺酶釋放。

有報道銀杏內(nèi)酯對肝硬變具有潛在療效。銀杏苦內(nèi)酯具有促進體外培養(yǎng)肝細胞增殖的作用。銀杏內(nèi)酯能有效地改善CCl4腹腔注射大鼠肝纖維化模型肝組織纖維化程度，顯著降低肝纖維化大鼠肝組織 PAF、TNF、ET-1 及 MDA 水平，說明其具有一定的抗過氧化反應和清除自由基的作用[28]。結(jié)扎膽管而致肝硬化的老鼠中，靜注銀杏內(nèi)酯能大大降低肝門靜脈壓，同時降低心臟指數(shù)、門靜脈分支的血液流量。

4.4對呼吸系統(tǒng)的作用 血小板活化因子(PAF)是哮喘的重要介質(zhì)之一。它能引起哮喘的多種病理學變化，在氣管炎癥和支氣管高敏反應中具有重要作用。銀杏內(nèi)酯可明顯拮抗哮喘患者由抗原引起的早期支氣管收縮并抑制支氣管高反應性而無副作用。銀杏內(nèi)酯吸入劑能對抗哮喘豚鼠氣道嗜酸性粒細胞浸潤[29],可作為治療支氣管哮喘的一種新方法。比較BN-52021與內(nèi)母核衍生物的另一種PAF拮抗藥(SRI-63072)的抑制支氣管收縮的作用[30], 研究顯示,BN-52021可降低兔肺低氧性肺動脈高壓,為防治低氧性肺動脈高壓提供了新的治療方案。

4.5對泌尿生殖系統(tǒng)的作用 銀杏內(nèi)酯能抑制PAF、內(nèi)毒素及肌注甘油等引起的鼠腎小球濾過速度和腎血流量的減少。麻醉鼠左腎動脈閉塞30 min后放松，BN-52021能迅速增加其尿流量、腎小球濾過速度和鈉排泄物,提示BN-52021能治療腎損傷。銀杏內(nèi)酯可減輕大鼠急性腎中毒模型的蛋白尿和組織病理學損傷，可預防性甚至治愈性的降低阿霉素對大鼠的致死率及蛋白尿。銀杏內(nèi)酯B能抑制FN、LN和ColⅣ的分泌,減輕腎小球系膜細胞外基質(zhì)的積聚,從而起到腎臟保護作用[31]。以腎小球內(nèi)無炎癥細胞浸潤為特征的腎病早期大鼠腎皮質(zhì)中PAF、TNF-α含量升高,使用拮抗劑銀杏內(nèi)酯干擾腎病大鼠,可使腎皮質(zhì)組織中PAF、TNF-α含量顯著降低,并與腎小球損傷減輕相平行[32]。銀杏內(nèi)酯對腺嘌呤造成的慢性腎功能不全大鼠有一定療效[33],低、中劑量可顯著降低BUN、Crea的升高,低劑量組還可顯著降低CH的升高。

用人促性腺激素刺激老鼠排卵，發(fā)現(xiàn)BN-52021能阻止卵泡破裂、卵巢膠質(zhì)溶解和血管滲透性增加。將PAF注射到子宮中會導致假孕老鼠的類似蛻膜反應，而BN-52021能抑制此類蛻膜反應。

4.6對器官移植排斥反應的作用 大量研究證實,銀杏內(nèi)酯對器官移植排斥反應具有保護作用。從豚鼠到老鼠的心臟異位移植和正位肝異種移植中同樣發(fā)現(xiàn)BN-52021能延長移植物的存活時間。近來，有人對肺的保存進行了研究，證實BN-52021能大大延長肺的保存時間和改善被保存肺的功能，因此銀杏內(nèi)酯可應用于肺移植的供體和受體中，使遠距離肺移植成為可能。其機制可能與BN-52021能對抗發(fā)生于移植器官中動脈粥樣硬化損傷有關。

4.7其他 銀杏內(nèi)酯能阻止PAF引起的內(nèi)耳電位(尤其內(nèi)淋巴位)的變化，抑制速尿靈導致的耳蝸變化。PAF能引起兔眼內(nèi)壓的增加，而銀杏內(nèi)酯能消除其過高壓力，同時也降低眼房水中因激光照射虹膜而增加的PGE2和蛋白含量。BN-52063(由40%的BN-52021及其他介質(zhì)拮抗劑等組成)依賴劑量抑制鼠的接觸性皮炎。BN-52021能抑制抗原引起的兔關節(jié)炎。銀杏內(nèi)酯A、B、C或單用銀杏內(nèi)酯B可以用于轉(zhuǎn)移癌的治療，能提高抗癌化療效果，減少不良反應。最近研究表明，BN-52021 對多發(fā)性硬化癥、腎移植和革蘭陰性的膿毒有效且耐受性良好；而白果內(nèi)酯可防治卡氏肺囊蟲肺炎，據(jù)稱比復方新諾明更有效。

5 展望

我國在銀杏藥用資源開發(fā)和應用方面，具有有利條件和獨特優(yōu)勢。從很多臨床實驗和病例的客觀資料顯示，銀杏葉制劑能改善血管系統(tǒng)的各種疾病，而且毫無副作用。這種神奇而優(yōu)良的功效不是一般的化學藥劑所能比擬的。目前，在臨床上應用的銀杏類藥物多為采用有效部位為主藥的復方制劑，隨著銀杏葉中有效藥用成分的研究的深入，國外正在進行銀杏內(nèi)酯混合物和銀杏內(nèi)酯純品的臨床試驗研究。銀杏內(nèi)酯A、B和C的混合制劑已進入Ⅲ期臨床研究，應用于哮喘的治療并對它在敗血癥休克、大腦缺血、腎移植和燒傷病人治療中的有效性進行評價。國內(nèi)以有效成分銀杏內(nèi)酯為主的制劑也正在研制當中，我國自主研發(fā)的銀杏內(nèi)酯注射液臨床試驗已初步證明，該藥可以治療包括急性缺血性腦梗塞在內(nèi)的缺血性腦病,有望成為急性腦缺血性類疾病治療藥物的新選擇。相信隨著對銀杏內(nèi)酯的進一步研究，新型、高效的銀杏葉制劑必將很好的為人類服務。

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2011-05-11

[修回日期]2011-06-21

AdvancesinterpenetrilactonesofGinkgoleaves

LIU Bin-guo，ZHANG Xin-ping，LIU Yan

(254th Hospital of PLA，Tianjin 300142, China)

Of all the compound classes present inG.biloba, the terpene trilactones had

the most attention. The ginkgolides and bilobalide were selective platelet-activating factor antagonists and widely applied in the illness of blood vessel of heart and brain. Studies on the chemical constituents, extraction and separation, the determination of content and the pharmacological activity about terpene trilactones of Ginkgo leaves were summarized and the study prospect were made.

terpene trilactones; chemical constituents; extraction; platelet-activat-ing factor

劉彬果(1972-)，女，博士.主管藥師.Tel：13682066620；(022)84683162，E-mail: lbg991227@163.com.

R931.6

A

1006-0111(2011)06-0421-05