李進，鄧豫，李兆明，曹小年，李小蘭，陶德定，胡俊波，王晶

(華中科技大學同濟醫(yī)學院1.附屬同濟醫(yī)院分子醫(yī)學中心;2.免疫教研室，武漢 430030)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種非特異性炎癥性腸病。臨床表現(xiàn)以反復發(fā)作或持續(xù)性的腹痛、黏液膿血便、腹瀉為主，屬于慢性非特異性炎癥，其特點是病程長，反復發(fā)作，遷延不愈，難以根治［1］。免疫學發(fā)病機制和腸道菌叢紊亂，特別是細胞因子的發(fā)病機制越來越受到重視，促炎性細胞因子與抑炎性細胞因子之間的平衡失調(diào)所導致的免疫異常被視為UC的重要發(fā)病機制之一［2］。2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導的結(jié)腸炎模型，在臨床和免疫等方面與人類炎癥性腸病極為相似［3］。美沙拉嗪緩釋劑是一種緩釋劑型的5-氨基水楊酸，治療UC療效確切，可以抑制引起炎癥的前列腺素的合成和炎性遞質(zhì)白三烯的形成，從而對腸黏膜的炎癥起顯著抑制作用，用于UC、潰瘍性直腸炎和克隆病(Crohn＇s disease)。筆者在本研究通過觀察美沙拉嗪緩釋劑治療UC大鼠后大鼠腸組織炎癥變化，過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性、腸組織和血清中細胞因子腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1β 和 IL-6的蛋白水平的表達情況，為治療UC提供一些實驗參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，購于湖北省疾病預(yù)防控制中心動物中心。TNBS購自Sigma公司，美沙拉嗪緩釋劑(商品名:艾迪沙，法國愛的發(fā)制藥集團)，5-氨基水楊酸(5-aminosalicylic acid，5-ASA)購于 Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 將40只雄性Wistar大鼠，隨機分為正常對照組、模型組、藥物治療組、陽性對照組，每組10只。除正常對照組外，其他3組造模。適當修改文獻［4-5］方法，大鼠禁食不禁水24 h后開始制備模型。用1%戊巴比妥鈉(100 mg·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠后，打開腹腔，提出結(jié)腸，在距盲腸5～6 cm的結(jié)腸處輕柔將大便擠向兩側(cè)，在擠空的2～3 cm的結(jié)腸兩端分別墊0.9%氯化鈉溶液紗布，用夾子夾住兩端，再將5%TNBS按50 mg·kg-1加入等體積50%乙醇，經(jīng)1 mL注射器注入結(jié)腸內(nèi)，3 min后松開夾子，將結(jié)腸放入腹腔中并關(guān)閉腹腔。造模后第1天，藥物治療組每只灌胃美沙拉嗪溶液100 mg·kg-1·d-1，模型組則灌胃等量0.9%氯化鈉溶液，正常對照組給予自由飲食，陽性對照組灌胃5-ASA 100mg·kg-1·d-1，連用7 d。每日觀察大鼠一般狀況及大便性狀，記錄體質(zhì)量。

1.2.2 標本收集 藥物治療7 d后，1%戊巴比妥鈉(100 mg·kg-1)深度麻醉大鼠，將其仰臥固定于手術(shù)臺，處死大鼠，分離結(jié)腸組織，沿腸系膜縱軸剪開，冰0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，留取病變結(jié)腸組織分為3份(每份約100 mg):1份放入10%甲醛溶液送病理，進行組織學損傷觀察，另2份冷凍管液氮保存?zhèn)溆糜贛PO和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測。

1.2.3 腸組織MPO活性的檢測 MPO試劑盒為南京建成公司產(chǎn)品，酶活力單位定義:每克組織濕片在37℃的反應(yīng)體系中被過氧化氫(H2O2)分解1μmol為一個酶活力單位，以U·g-1表示。MPO單位/克組織=(測定管A值-對照管A值)/(11.3×取樣量)。腸黏膜MPO活性的測定按MPO試劑盒說明檢測。

1.2.4 腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA水平檢測 ①組織中總RNA的提取:用TRIzol試劑盒說明一步法提取。②RNA定量及電泳鑒定:取RNA樣品10μL，用紫外分光光度儀測A值。RNA純度=A260/A280。RNA濃度=A260×40，經(jīng)甲醛變性凝膠電泳分析RNA提取質(zhì)量。③第一鏈互補DNA(cDNA)的合成:用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成的cDNA放入-20℃凍存。④實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR:采用SYBR(R)Premix Ex TaqTMRTPCR試劑盒(全式金)和MX3000P熒光定量PCR儀，按說明書操作。TNF-α、IL-1β、IL-6和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因引物由上海英俊公司合成，序列如下:IL-1β:5＇-TGTGATGTTCCCATTAGAC-3＇(forward)，5＇-AATACCACTTGTTGGCTTA-3＇(reverse)。IL-6:5＇-CCACTGCCTTCCCTACTT-3＇(forward)，5＇-TTGCCATTGCACAACTCT-3＇(reverse)。TNF-α:5＇-CCACGCTCTTCTGTCTACTG-3＇(forward)，5＇-GCTACGGGCTTGTCACTC-3＇(reverse)。GAPDH:5＇-GGCAAGTTCAACGG-CACAGTCA-3 ＇(forward)， 5＇-CTCAGCACCAGCATC-ACCCCAT -3＇(reverse)。擴增片段長度分別為122，138，117，137 bp。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 實驗重復3次，取其平均值，以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用SPSS 12.0分析實驗數(shù)據(jù)，比較各組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況 造模后第1天即出現(xiàn)腹瀉，模型組大鼠實驗過程中一直有腹瀉，部分出現(xiàn)肉眼血便。藥物治療組大鼠灌胃給藥治療后腹瀉次數(shù)減少，部分有隱血陽性，一直未出現(xiàn)肉眼血便。正常對照組大鼠無改變。陽性對照組大鼠癥狀改善不明顯。

2.2 組織病理改變 正常對照組大鼠直結(jié)腸組織見腺體排列整齊，隱窩正常，杯狀細胞無減少，未見黏膜糜爛、出血，模型組鏡下可見腺管排列紊亂，或者消失黏膜及黏膜下層血管高度擴張充血，大量炎細胞浸潤，浸潤黏膜下或固有層，部分浸潤全層，以中性粒細胞、淋巴細胞為主。藥物治療組鏡下黏膜及黏膜淺層僅有少量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，組織損傷較輕，炎癥程度較模型組明顯減輕。陽性對照組可見黏膜消失或部分消失，腺體排列紊亂，炎性細胞浸潤，但較模型組有所減輕。見圖1。

2.3 腸黏膜MPO活性檢測 模型組MPO的活性為(1.82±0.34)，藥物治療組為(0.63±0.11)，陽性對照組為(1.48±0.26)，正常對照組為(0.12±0.025)，藥物治療組較模型組和陽性對照組表達量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)，陽性對照組較模型組表達量有所減少，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.4 結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表達水平檢測 結(jié)果見圖2。藥物治療組與模型組或陽性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。陽性對照組較模型組表達量有所減少，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

目前認為細胞因子的失衡是UC產(chǎn)生腸道非特異性炎性反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［6-8］。與UC關(guān)系密切的促炎細胞因子主要有 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 等，抑炎細胞因子主要有IL-4、IL-10等，它們可同時或相繼、直接或間接作用靶細胞，形成細胞因子的網(wǎng)絡(luò)，在UC的組織破壞及炎性反應(yīng)中起著重要作用［9］。

圖1 4組大鼠腸黏膜病理圖片(HE，×100)A.正常對照組;B.模型組;C.藥物治療組;D.陽性對照組Fig．1 The pathological images of intestinalmucosa of rats in four groups(HE，×100)A.the normal control group;B.themodel control group;C.the drug treatment group;D.the positive control group

圖2 4 組 TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA 相對表達量A.正常對照組;B.模型組;C.藥物治療組;D.陽性對照組;與模型組或陽性對照組比較，*1 P＜0.05Fig．2 Them RMA relative expression of TNF-α，IL-1β and IL-6 in four groups A.the normal control group;B.themodel control group;C.the drug treatmentgroup;D.the positive controlgroup;Compared with the

IL-1β曾被稱作淋巴細胞激活因子，主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生。EVENIKOA等［10］發(fā)現(xiàn)UC患者IL-1β model control group and the positive control group，*1P ＜0.05主要是局部發(fā)揮作用，在UC有隱窩炎癥時，腸液中IL-1β含量明顯增加，與抗原協(xié)同作用，使CD+4T細胞活化，IL-2R表達，促進B細胞生長和活化，促進單核巨噬細胞等抗原遞呈細胞的抗原的表達，吸引中性粒細胞聚集，引起炎癥遞質(zhì)釋放。丁偉群等［11］研究發(fā)現(xiàn)IL-1β在受累黏膜顯著的升高，未受累黏膜IL-1β也明顯高于正常組，說明IL-1B確實參與UC發(fā)生和發(fā)展過程。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1βmRNA在模型組相對于GAPDH的表達量達到59.4%，較其他促炎因子明顯增高。說明IL-1β可能在UC發(fā)病的初始階段和進展階段均起著非常重要的作用。本實驗采用的造模方法在傳統(tǒng)的造模方法上進行了適當修改，其優(yōu)點是誘導的UC病變部位固定，大小、炎癥程度穩(wěn)定，并且大鼠的死亡率降低，便于在實驗過程中進行觀察和比較干預(yù)效果及減少個體差異性。美沙拉嗪是一種控釋劑型的5-氨基水楊酸，治療UC療效確切，其在胃和小腸內(nèi)不被吸收、分解，到達結(jié)腸后才緩慢釋放5-ASA，作用于結(jié)腸炎癥黏膜。本研究證實大鼠應(yīng)用美沙拉嗪治療后，顯著改善UC的癥狀，MPO的活性明顯低于模型組和陽性對照組，表明美沙拉嗪具有減輕腸黏膜水腫，對抗炎性細胞浸潤，發(fā)揮抗炎作用。同時與模型組和陽性對照組相比明顯抑制了促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 基因的轉(zhuǎn)錄活性，降低了 TNF-α、IL-1β、IL-6細胞因子的表達，從而減輕了炎癥反應(yīng)，而陽性對照組治療效果不明顯，與其在上消化道被吸收，到達病變部位的量少有關(guān)，同時證實美沙拉嗪通過在結(jié)腸內(nèi)緩慢釋放5-ASA，作用于病變部位的黏膜，抑制炎性水腫、炎性細胞的浸潤，及促炎因子的表達從而發(fā)揮了治療潰瘍性結(jié)腸炎的目的。為其臨床應(yīng)用價值提供了一定的理論依據(jù)。

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