鄧豫，王桂華，左學(xué)良，董碩，金源，李維娜，龔建平，胡俊波

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1.腫瘤研究所/胃腸外科;2.感染性疾病研究所，武漢 430030)

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)是連接胞外細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)與信號(hào)通路的重要蛋白，參與了細(xì)胞增殖、凋亡、分化及糖代謝等重要作用［1］。研究表明，PI3K的活性與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2-4］。2003 年，XIA 等［5］發(fā)現(xiàn):PI3K調(diào)節(jié)亞基p55PIK氨基端(N末端)的24個(gè)氨基酸(N24)能夠結(jié)合細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白R(shí)b，并使后者磷酸化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。胡俊波等［6-11］在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí):高表達(dá)N24能夠抑制胃癌、肝癌和結(jié)腸癌等細(xì)胞的生長(zhǎng)。為了高效安全地將N24應(yīng)用于腫瘤治療，胡俊波等合成并純化了TAT-N24穿膜融合多肽(簡(jiǎn)稱TAT-N24)，研究證實(shí)其能有效抑制結(jié)腸癌等的生長(zhǎng)［12-14］，這為針對(duì)PI3K信號(hào)通路的分子靶向治療開辟了新的手段。前列腺癌(prostate carcinoma，PC)是較常見的男性惡性腫瘤，且發(fā)病率逐年上升［15］，40 a來(lái)發(fā)病率增加了近5倍［16］。前列腺癌的治療以手術(shù)為主，輔以內(nèi)分泌治療等，預(yù)后較差。近年來(lái)分子靶向治療在腫瘤治療領(lǐng)域進(jìn)展迅速，筆者在本研究將初步探討TAT-N24對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 前列腺癌PC3細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)，高糖達(dá)爾伯克改良必需基本培養(yǎng)基(dulbecco＇smodified minimal essentialmedium，DMEM)及胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司，鼠抗人BrdU單抗購(gòu)于Santa Cruz公司，異硫氰酸熒光素(fluorescein isthiocyanate，F(xiàn)ITC)熒光標(biāo)記的IgG購(gòu)于丹麥Dako公司，流式細(xì)胞儀FACSort由美國(guó)Becton Dickson公司生產(chǎn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 PC3細(xì)胞用含10%小牛血清和雙抗(青霉素100 U·mL-1及鏈霉素 100μg·mL-1)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融匯度為60%～70%時(shí)分為TAT-N24多肽組，對(duì)照多肽組(終濃度均為100μg·mL-1)和無(wú)干預(yù)對(duì)照組(空白組)，24 h后收取細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.3 BrdU/PI雙摻法測(cè)定細(xì)胞DNA合成 PC3細(xì)胞接受相應(yīng)干預(yù)24 h后，加入BrdU，終濃度為10μmol·L-1，30min后用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)洗1次后用75%冰乙醇固定，-20℃保存過(guò)夜。取固定后細(xì)胞PBS洗1次，PBS-T［含 0.1% 苯磺酸(benzenesulfonic acid，BSA)，0.2%聚山梨酯20］洗1次，2 mol·L-1鹽酸作用45 min，以0.1 mol·L-1四氫硼砂(pH=8.0)洗1次，PBS-T(含0.1%BSA，0.2%聚山梨酯20)洗1次，加鼠抗人BrdU一抗(1∶100)，37℃孵育2 h，PBS洗3次后再加FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶20)，室溫孵育1 h，PBS洗3次，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)，終濃度為4 μmol·L-1，和 RNAase，終濃度為2 μg·mL-1，室溫孵育15 min，后放入流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) PC3細(xì)胞接受相應(yīng)干預(yù)24 h后，用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗2次后，用適量放射免疫沉淀測(cè)定(radioimmune precipitation assay，RIPA)細(xì)胞裂解液冰上裂解30min，4℃下，12 000 r·min-1(離心機(jī)半徑10 cm)離心10 min，取上清液，加等體積2×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)上樣緩沖液，混勻后置于100℃水浴5 min。蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚偏二氯乙烯(polyvinylidene dichloride，PVDF)膜轉(zhuǎn)膜(350 mA，90 min)，5%BSA封閉非特異性結(jié)合，然后孵育一抗［兔抗人硫酸甘油醛脫氫酶(phosphoribosyl glucinamide synthetase，GAPDH)、總蛋白激酶 B(protein kinase B，又稱AKT)及磷酸化AKT抗體］，4℃過(guò)夜。次日用 TBST洗3次，然后孵育辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的抗兔IgG，室溫孵育2 h后，TBST洗3次，每次15 min，最后用電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)顯色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件對(duì)組間進(jìn)行均數(shù)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAT-N24對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞DNA合成的影響對(duì)目的時(shí)間收取并固定的細(xì)胞進(jìn)行BrdU摻入法染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞合成期(S期)的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞比例。結(jié)果顯示:空白組(37.9±3.2)%，對(duì)照多肽組(36.2±4.1)%，TAT-N24組(21.5% ±2.4)%;TAT-N24組與空白組和對(duì)照多肽組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示:TAT-N24能有效抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的DNA合成。

2.2 TAT-N24對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞系細(xì)胞周期的影響 上述細(xì)胞BrdU染色后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，進(jìn)行細(xì)胞周期分析。結(jié)果顯示:空白組G0/G1期(56.9±6.1)%，S期(27.0±2.3)%，G2/M 期(16.1±1.3)%;對(duì)照多肽組G0/G1期(57.9±4.8)%，S期(24.2±3.1)%、G2/M 期(27.8±1.4)%。TAT-N24組G0/G1期(68.6±5.4)%，S期(19.4±1.5)%，G2/M 期(12.3±1.4)%.結(jié)果提示:TAT-N24能有效阻滯PC3細(xì)胞周期進(jìn)程于G0/G1期。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示TAT-N24組與其他兩組G0/G1期細(xì)胞比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 TAT-N24對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞系的AKT磷酸化的影響 PI3K下游信號(hào)通路的活性主要表現(xiàn)為AKT的磷酸化狀態(tài)，AKT磷酸化后進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活等。細(xì)胞處理至目的時(shí)間，收集細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，觀察 TAT-N24對(duì) PC3細(xì)胞的AKT磷酸化水平的影響。應(yīng)用NIH Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析，組間進(jìn)行均數(shù)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示TAT-N24對(duì)PC3細(xì)胞的AKT磷酸化水平無(wú)明顯影響。見圖1。

3 討論

PI3K是由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基形成的異二聚體結(jié)構(gòu)，二者結(jié)合后能夠激活下游信號(hào)通路［17］。研究表明該通路在多種人類實(shí)體腫瘤中異?；罨?8］。針對(duì)PI3K信號(hào)通路的抑制劑在腫瘤治療方面取得了較大進(jìn)展。但由于這些經(jīng)典的PI3K抑制劑最終通過(guò)抑制AKT磷酸化水平而發(fā)揮作用，這影響了PI3K的正常生理功能，導(dǎo)致高血糖和免疫失衡等不良反應(yīng)［18］。

P55PIK是PI3K的調(diào)節(jié)亞基之一，同其他調(diào)節(jié)亞基一樣具有較為保守的結(jié)構(gòu)域，除此之外，其氨基端(N端)的24個(gè)氨基酸(N24)是其區(qū)別于其他調(diào)節(jié)亞基的最重要的特征［5］。此外 XIA等［5］發(fā)現(xiàn) N24能夠結(jié)合并磷酸化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白R(shí)b，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。因此，在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)N24可能影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。

圖1 3組前列腺癌PC3細(xì)胞的AKT磷酸化的比較A.空白組;B.對(duì)照多肽組;C.TAT-N24組Fig．1 The comparison of AKT phosphorylation of prostate cancer cell line PC3 in three groups A.the blank group;B.the control peptide group;C.the TATN24 group

本研究顯示:TAT-N24能有效抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的DNA合成，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程于G0/G1期。其可能的機(jī)制為:外源性N24通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Rb蛋白，降低了內(nèi)源性p55PIK對(duì)Rb的磷酸化作用，進(jìn)而影響Rb對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期，同時(shí)抑制細(xì)胞的DNA合成。此外，結(jié)果提示TATN24未影響PI3K經(jīng)典通路下游AKT的磷酸化水平，在減少不良反應(yīng)方面，這可能比經(jīng)典的PI3K/AKT抑制藥更具優(yōu)勢(shì)，但此點(diǎn)有待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。TAT-N24作為特異性抑制p55PIK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子靶向藥物，具有較好應(yīng)用前景。

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