溫輝芹，裴自友，任永康

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030032）

百薩偃麥草（Thinopyrum bessarabicum，2n=2x=14，JJ）為自花授粉的多年生海岸禾草，原產(chǎn)于黑海和地中海沿岸，是偃麥草屬中基因組最簡(jiǎn)單的二倍體物種。J 染色體是偃麥草屬的基本染色體組，在小麥親緣物種中，J 染色體組僅次于S，廣泛分布于多倍體物種中。百薩偃麥草對(duì)環(huán)境脅迫和生物脅迫具有很強(qiáng)的抗性，是小麥遺傳改良的重要資源[1]。

分子原位雜交（In Situ Hybridization，ISH）是在分子水平上檢測(cè)外源染色質(zhì)的一種有效方法，根據(jù)所用探針不同分為物種?；貜?fù)序列原位雜交、基因組原位雜交和單拷貝或寡拷貝序列原位雜交等。高等植物的基因組內(nèi)含有大量的重復(fù)DNA 序列，根據(jù)其拷貝數(shù)將重復(fù)序列劃分為衛(wèi)星DNA（高度串聯(lián)重復(fù)序列）、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA（中度串聯(lián)重復(fù)序列）、轉(zhuǎn)座子（中度彌散、具轉(zhuǎn)座功能）[2]。利用重復(fù)序列ISH 分子核型的建立對(duì)染色體的識(shí)別非常有效。Mukai 等[3]根據(jù)pSc119.2和pAs1 這2 個(gè)重復(fù)序列的雙色原位雜交，建立了普通小麥的分子核型，可以識(shí)別全部21 條染色體中的17 條。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR） 又稱微衛(wèi)星DNA（microsatellites DNA），它是一類由1～6 個(gè)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA 序列，其長(zhǎng)度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置。研究表明，一個(gè)基因的不同位點(diǎn)的SSR 在調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和決定產(chǎn)物上起著重要作用。SSR 標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于遺傳圖譜的構(gòu)建、品種指紋圖譜的繪制以及目標(biāo)性狀基因標(biāo)記篩選、起源進(jìn)化等領(lǐng)域[4]。Pedersen等[5-6]發(fā)現(xiàn)，來(lái)自大麥的pHvG38 克隆（GAA-衛(wèi)星序列）可以在大麥、小麥、黑麥以及其他小麥族物種染色體上產(chǎn)生與N-帶完全一致的核型圖譜，利用pHvG38 和克隆pAs1 的雙色原位雜交建立了可以區(qū)分普通小麥全部21 條染色體的分子核型。目前，利用標(biāo)記的簡(jiǎn)單重復(fù)序列進(jìn)行的原位雜交開(kāi)展了對(duì)甜菜、鷹嘴豆、六倍體普通小麥、大麥、黑麥、小黑麥、果蠅和人類染色體上微衛(wèi)星物理位點(diǎn)的研究[5，7-13]。

本研究以簡(jiǎn)單重復(fù)序列（AAG）5為探針，進(jìn)行熒光原位雜交，檢測(cè)其在百薩偃麥草上的位置，建立百薩偃麥草的（AAG）5熒光核型。

1 材料和方法

1.1 材料

百薩偃麥草由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所保存。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（AAG）5由日本葛萊娜有限公司合成、日本鳥取大學(xué)農(nóng)學(xué)部植物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 根尖細(xì)胞染色體制片 百薩偃麥草種子發(fā)芽前先浸種處理24 h，然后將種子放在墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)于4 ℃冰箱中處理1 周左右，再放到23 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽，待根長(zhǎng)約1～2 cm 時(shí)剪取根尖，在冰水中預(yù)處理22～24 h 后，用酒精-冰醋酸（3∶1）固定液固定。用45%醋酸洋紅制片，-70 ℃冰箱冰凍揭片。

1.2.2 探針標(biāo)記 采用3′末端標(biāo)記方法（3′End labeling method），用tetramethyl-rhodamine-5-dUTP 標(biāo)記合成的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（AAG）5。反應(yīng)液配制：將1.5 mL 離心管置于冰上，依次加入5×TdT Reaction buffer 4 μL，終濃度為100 pmol/L的（AAG）5，CoCl2（25 mmol/L）4 μL，tetramethyl-rhodamine-5-dUTP（25 nmol/μL，Roche）1 μL，Terminal Transferase rec 1 μL，最后加ddH2O 至總體積為20 μL，混合、離心后，37 ℃溫育15 min，再將離心管置于冰上，加入Stop buffer（0.2 mol/L EDTA，pH 值為8.0）2 L，混勻，放入-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 熒光原位雜交（FISH）及信號(hào)檢測(cè) 熒光原位雜交主要參照Kishii 等[14]的程序，具體如下。

（1）制片變性：根尖制片放置于0.2 mol/L NaOH/70%Ethanol，室溫條件下5 min，變性后的制片在-20 ℃的70%，90%，100%乙醇溶液中各5 min 梯度脫水，雜交前氣干備用。

（2）雜交液配制及變性：每10 μL 雜交液含去離子甲酰胺（Formamide）5 μL，50% Dextran sulfate 2 μL，20×SSC 1μL，探針（AAG）50.5 μL，ddH2O 1.5 μL。輕輕混勻，100 ℃下變性5 min，然后立即放置于碎冰中冷卻5 min 以上。

（3）雜交：每張制片加10 μL 探針混合液，用18 mm×18 mm 的蓋玻片蓋好（膠水封住四周），放置于有濕潤(rùn)濾紙的塑料盒內(nèi)，37 ℃雜交過(guò)夜。

（4）洗片：取出充分雜交的制片，用鑷子小心去掉膠水和蓋玻片，在0.1%TritonX-100/2×SSC室溫下洗脫5 min，2×SSC 室溫浸洗5 min，用洗耳球吹干。

（5）染色及鏡檢：制片加10 μL 用VECTA shield（Vector）膠配置的DAPI 套染和封片，蓋上蓋片（20 mm×20 mm），用Olympus BX61 熒光顯微鏡觀察、照相。各染色體根據(jù)臂比和熒光帶型用Adobe PhotoShop 6.0 軟件編輯排列。

2 結(jié)果與分析

以簡(jiǎn)單重復(fù)序列（AAG）5為探針，對(duì)百薩偃麥草的熒光原位雜交結(jié)果如圖1 所示。圖1 結(jié)果表明，（AAG）5在百薩偃麥草的絕大部分染色體上具有明顯的熒光帶紋，可以很好地將7 對(duì)百薩偃麥草染色體區(qū)分開(kāi)來(lái)。熒光信號(hào)在不同的百薩偃麥草染色體上的強(qiáng)弱不同，而且在不同位點(diǎn)也有變化，信號(hào)的強(qiáng)弱反映了拷貝數(shù)的多少。

由于百薩偃麥草每條染色體所屬的部分同源群尚不清楚，用J1～J7表示百薩偃麥草7 對(duì)染色體，建立了百薩偃麥草7 對(duì)染色體的（AAG）5熒光原位雜交核型排列圖（圖2）。各染色體（AAG）5熒光帶型特征為：染色體J1，染色體最長(zhǎng)，有很弱的著絲粒帶和長(zhǎng)臂中間帶；染色體J2，染色體短臂無(wú)帶、具長(zhǎng)臂中間帶；染色體J3，無(wú)明顯帶紋；染色體J4，有較強(qiáng)的著絲粒帶，長(zhǎng)臂具近著絲粒帶；染色體J5，長(zhǎng)、短臂均有強(qiáng)的近著絲粒帶；染色體J6，具有著絲粒帶、長(zhǎng)臂近著絲粒帶和中間帶；染色體J7，具有著絲粒帶。

3 討論

簡(jiǎn)單重復(fù)序列分布于編碼區(qū)和非編碼區(qū)，通常與異染色質(zhì)相關(guān)聯(lián)。許多重復(fù)序列在小麥近緣種甚至不同屬間是共享的，但在不同基因組中分布模式是不同的[2]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列的FISH 結(jié)果表明，SSR 在染色體上有成簇分布的，也有彌散分布的[15]。目前，利用的有單堿基、2 個(gè)堿基、3 個(gè)堿基和4 個(gè)堿基重復(fù)的長(zhǎng)度在15～20 bp 的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，并建立了在有絲分裂、減數(shù)分裂染色體和線性染色體上鑒定目的簡(jiǎn)單重復(fù)序列富集區(qū)的非變性熒光原位雜交方法[16]，這將有益于基因組分析和簡(jiǎn)單重復(fù)序列在染色體上的結(jié)構(gòu)功能的研究。合成的寡核苷酸探針（簡(jiǎn)單重復(fù)序列）由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，相對(duì)分子質(zhì)量小，雜交效率明顯高于長(zhǎng)探針；寡核苷酸探針可識(shí)別靶序列內(nèi)1 個(gè)堿基的變化，具有可大量人工合成、價(jià)格低廉等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)高度重復(fù)序列與簡(jiǎn)單重復(fù)序列作探針的多色FISH 和多重FISH 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建染色體物理圖譜，進(jìn)行基因組分析、核型關(guān)系、遺傳多樣性和進(jìn)化的研究，還可發(fā)現(xiàn)進(jìn)化過(guò)程中的染色體重排。

已有45SrDNA 在百薩偃麥草染色體上的分布研究[17-18]，今后應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合其他的重復(fù)序列，如pAs1，pSc119，pTa794（5SrDNA）和簡(jiǎn)單重復(fù)序列的熒光原位雜交相結(jié)合對(duì)同一個(gè)有絲分裂中期細(xì)胞的染色體進(jìn)行連續(xù)、多色FISH，建立每條染色體的綜合熒光核型。本研究表明，（AAG）5在供試的百薩偃麥草的各染色體間存在很大的差別，百薩偃麥草（AAG）5位點(diǎn)的鑒定，為在分子水平上研究小麥族的物種起源與進(jìn)化提供了新的信息。本研究中發(fā)現(xiàn)用熒光素（Fluorescein-12-dUTP）標(biāo)記（AAG）5的效果（熒光信號(hào)強(qiáng)度）要差些，因此，在采用熒光素標(biāo)記作探針時(shí)，雜交液中要適當(dāng)加大探針的用量，以獲得理想的效果。這與王蘇玲和莊麗芳等[19-20]的研究結(jié)果一致。本研究未發(fā)現(xiàn)百薩偃麥草有明顯的隨體染色體，而Endo 等[21]的結(jié)果卻顯示百薩偃麥草具有2 對(duì)隨體染色體。具體各同源群的百薩偃麥草染色體熒光帶型的確定還需要利用全套的中國(guó)春-百薩偃麥草二體異附加系作進(jìn)一步研究，但研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入小麥背景的百薩偃麥草染色體存在染色體重排現(xiàn)象[22]，因?yàn)槿旧w結(jié)構(gòu)的微小變化往往表現(xiàn)為帶型的多態(tài)性。說(shuō)明在百薩偃麥草的進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了較多的變化，為今后的鑒定帶來(lái)了一定的難度。

不同物種的染色體C-分帶帶型有明顯的差異，因而可用作鑒別物種的依據(jù)[19]。染色體分帶作為常用的細(xì)胞學(xué)鑒定手段，其效果受染色體制片質(zhì)量和吉姆薩（Giemsa）染液的影響較大。利用重復(fù)序列的染色體識(shí)別技術(shù)是分帶技術(shù)的有益補(bǔ)充。分帶大多只能在組成性異染色質(zhì)區(qū)產(chǎn)生帶紋，對(duì)于異染色質(zhì)少的染色體的鑒定往往成效不大。利用不同的重復(fù)序列探針可以產(chǎn)生不同的分子核型，基因組原位雜交（GISH）、多個(gè)重復(fù)序列探針相結(jié)合的雙色或多色FISH 技術(shù)以及分子標(biāo)記等多種技術(shù)相結(jié)合可以更高效地識(shí)別染色體的身份。

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