徐 婧，楊光忠

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

劍葉龍血樹Dracaenacochinchinenis(Lour.) S.C.Chen系龍舌蘭科(Agavaceae)龍血樹屬(Dracaena)，分布于云南、廣西、海南等地[1]，是藥材龍血竭的基源植物[2，3].龍血竭具有行瘀止痛、止血斂瘡等功效，有“活血圣藥”之稱[4].隨著龍血竭需求的不斷擴(kuò)大及對龍血樹資源的掠奪性采伐，龍血樹野生資源日趨枯竭，瀕危滅絕[5].目前對劍葉龍血樹的研究主要在其藥用[6，7]和有效成分[8，9]等方面，有關(guān)其種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性尚未見報道.對劍葉龍血樹開展種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性分析對于其種質(zhì)資源保護(hù)具有重要的理論指導(dǎo)意義.

DNA提取是植物分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù).運用高效快速的提取技術(shù)獲得高質(zhì)量的DNA產(chǎn)物，是利用分子標(biāo)記進(jìn)行植物種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析的前提[10].本文通過比較3種常用的DNA提取方法——CTAB法、SDS法和高鹽低PH法對劍葉龍血樹葉的DNA的提取效果，探討影響DNA提取的主要因素，優(yōu)選適合龍血樹葉片DNA提取的技術(shù)路線，為后續(xù)的龍血樹遺傳多樣性研究及遺傳育種工作提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

劍葉龍血樹葉采自廣西左江石景林公園.三氯甲烷、無水乙醇、EDTA、NaCl、乙酸鈉、異戊醇、異丙醇、Tris為國產(chǎn)分析純，CTAB、PVP(Biosharp Company)，瓊脂糖(Biowest公司)，β-羥基乙醇(AMRESCO Biotechnology).

CTAB法分離緩沖液：2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% 巰基乙醇；洗滌緩沖液：76% 無水乙醇，10 mmol/L乙酸銨.

SDS法預(yù)冷提取液：50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，3% PVP，2% β-巰基乙醇，50 mmol/L EDTA；裂解緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl，1.5% SDS.

高鹽低PH法預(yù)熱提取液：100 mmol/L NaAc，3% PVP，2% β-巰基乙醇，25 mmol/L EDTA，1.5% SDS；TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA.

冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5417R臺式，德國)，高壓雙穩(wěn)電泳儀(DYY-4C型，北京六一)，水平電泳槽(DYCP-31D型，北京六一)，自動凝膠圖像分析儀(JS 380，上海培清科技有限公司)，核酸蛋白紫外測定儀(Amersham Biosciences).

1.2 CTAB法提取DNA

取研磨后的葉片0.1 g于1.5 mL 離心管中，加入500 μL 65℃水浴預(yù)熱的CTAB分離緩沖液，輕輕轉(zhuǎn)動使之混勻，65℃水浴保溫30 min，隔10 min震搖1次.稍冷后，加500 μL氯仿/異戊醇(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)，顛倒混勻，7000 rpm離心10 min，吸上層水相加2倍體積的乙醇，輕混，10000 rpm離心10 min.棄上清，加1 mL洗滌緩沖液洗滌20 min，5000 rpm離心5 min，重復(fù)洗滌1次，將干燥透明狀DNA沉淀溶于100 μl TE緩沖液中，于-20℃保存?zhèn)溆?

1.3 SDS法提取DNA

取研磨后的葉片0.1 g于1.5 mL離心管中，加入500 μL預(yù)冷提取液，充分混勻后冰上放置10 min，6000 g離心5 min，棄上清，加入預(yù)冷提取液重懸，離心后棄上清，沉淀加入500 μL 65℃預(yù)熱的裂解緩沖液，65℃水浴30 min，不時輕輕顛倒.稍冷后加入500 μL氯仿/異戊醇(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)，顛倒成乳濁狀，10000 g 4℃離心10 min，重復(fù)2次，上清加入125 μL乙醇和55 μL 5 mol/L KAC(pH4.8)，立即10000 g 離心10 min.上清加入等體積-20℃預(yù)冷的乙醇，-20℃靜置30 min，10000 g 4℃離心20 min，用70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干后溶于100 mL TE，-20℃保存?zhèn)溆?

1.4 高鹽低PH法提取DNA

取研磨后的葉片0.1 g于1.5 mL離心管中，加入500 μL 65℃預(yù)熱提取液充分混勻后65℃中保溫30 min，不時輕輕顛倒，4℃ 10000 g離心10 min，取上清液加335 μL 2.5 mol/L KAC(pH4.8)，4℃放置15 min.10000 g 4℃離心10 min，上清液加等體積氯仿/異戊醇(V(氯仿)V(異戊醇)=24∶1)，振蕩至乳濁狀，靜置分層.10,000 g 4℃離心10 min，上清液加等體積的-20℃預(yù)冷乙醇，-20℃靜置30 min，10000 g 4℃離心20 min，70%乙醇洗滌2次，風(fēng)干后溶于100 mL TE，-20℃保存?zhèn)溆?

1.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測

配0.7%的瓊脂糖凝膠，將5 μL DNA樣品與1 μL溴酚藍(lán)混勻，5 μL上樣，120V，電泳30～40min，將凝膠移至0.5 μg/mL溴化乙啶溶液中浸泡約10 min后，紫外凝膠成像系統(tǒng)中拍照檢測DNA.

1.6 DNA純度、含量以及蛋白質(zhì)含量檢測

用TE緩沖液稀釋DNA樣品100倍，測定A280和A260.由A260/A280判斷DNA的純度，并根據(jù)A260計算DNA濃度、得率和蛋白質(zhì)含量[10，11].

DNA濃度(μg/μL)=50×A260×N.DNA得率(μg/g)=C×V/M.蛋白質(zhì)濃度(μg/μL)=1.45 A280-0.74 A260.(50為在標(biāo)準(zhǔn)厚度為1cm的比色皿中A260=1，相當(dāng)于50μg/μL的雙鏈DNA，N為稀釋倍數(shù)，C為DNA濃度，V為DNA體積，M為葉片質(zhì)量).

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果比較

對龍血樹葉片采用CTAB法、SDS法、高鹽低pH法提取DNA，凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1.由圖1可見，3種方法的DNA均無明顯的拖尾，說明DNA完整性好；DNA在點樣孔處均無高亮出現(xiàn)，說明蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)去除較為徹底，未受蛋白質(zhì)和多糖雜質(zhì)的污染.其中，CTAB法的DNA條帶最亮，濃度最高；高鹽低PH法的條帶較亮，濃度次之；SDS法條帶亮度最弱，濃度最低.圖1中1～3為3份不同隨機(jī)樣品，因為植物在不同器官、不同發(fā)育時期，組織中許多代謝物質(zhì)如酚類、多糖類、萜類等含量和成分各有不同，CTAB法中樣品2的濃度顯著高于樣品1和3，與樣品2所處的生長發(fā)育時期DNA含量較高相關(guān)，這是由基因表達(dá)產(chǎn)物等差異引起的，通常認(rèn)為 DNA提取效果以愈傷組織和幼嫩葉片為佳.

2.2 DNA濃度、純度和產(chǎn)率的比較

用紫外分光光度計檢測3種不同方法的DNA，得A280、A260、A260/A280、DNA濃度、得率和蛋白質(zhì)濃度，計算樣品1-3的平均值，結(jié)果見表1.由表1可見，CTAB法的DNA濃度和得率最高，蛋白質(zhì)濃度最低，提取效果最佳；SDS法提取的DNA濃度和得率低于其他2種方法，蛋白質(zhì)濃度高于其他2種方法，提取效果最差；高鹽低PH法提取的DNA和蛋白質(zhì)濃度居于其他2者之間.

1～3:隨機(jī)采集的不同龍血樹葉片樣本 a) CTAB法; b) SDS法; c) 高鹽低pH法

表1 3種提取方法所得DNA濃度和純度比較

3 討論

目前，關(guān)于植物總DNA的提取方法報道較多，最常見是CTAB法、高鹽低pH法和SDS法，3種方法各有其優(yōu)缺點.CTAB法中CTAB是一種去污劑，它既能裂解細(xì)胞，又可與DNA形成復(fù)合物而溶于高鹽溶液中，當(dāng)鹽濃度降低時此復(fù)合物析出，能較好地去除酚類及糖類等高分子雜質(zhì)，在提取前期獲得高含量的DNA.在對龍血樹葉片的DNA的提取中，該法DNA得率高，蛋白質(zhì)污染小，降解程度輕，可滿足后續(xù)分子檢測如PCR的要求，且實驗流程簡單、步驟少、操作簡便.高鹽低pH法中，低pH可有效防止組織破碎和沉淀大量材料時的電離化作用和酚類化合物的褐變，高鹽是有效的蛋白質(zhì)沉淀劑，該法簡便、經(jīng)濟(jì)，但所得DNA濃度和得率低于CTAB法.SDS法中SDS作為去污劑直接裂解細(xì)胞，使細(xì)胞釋放DNA，但該法因反應(yīng)條件溫和不能有效地去除糖類和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，故提取的DNA濃度與A260/A280值最低，蛋白質(zhì)污染最嚴(yán)重.

為提高DNA的濃度，降低雜質(zhì)含量，在本實驗中適當(dāng)加大了離心力和離心時間；使用幼嫩的植物葉片，因隨著植物的生長發(fā)育，多糖、多酚等次生代謝產(chǎn)物的含量提高，嚴(yán)重影響DNA的提取質(zhì)量；在提取液中加入β-巰基乙醇去除酚類，β-巰基乙醇有“-SH”能打斷多酚氧化酶的二硫鍵，使多酚氧化酶失活，防止酚類物質(zhì)被氧化，有效地防止了褐變[12]，故本實驗中3種方法所得到DNA均能較好地去除酚類化合物，所得DNA溶液均無色.

綜上所述，CTAB法提取的劍葉龍血樹葉片DNA的純度、濃度和得率等均優(yōu)于SDS法和高鹽低PH法，且實驗方法簡單、易于操作，故CTAB法是最適合于龍血樹葉片DNA的提取方法，為龍血樹后續(xù)的遺傳多樣性研究提供一定的參考理論依據(jù).

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