王立勤，邱 玲，林建國(guó)，南蓓蓓，羅世能，馬海霞，黃 潔

1.西北大學(xué) 化工學(xué)院，陜西 西安 710069；2.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214063

放射性核素骨顯像已成為臨床診斷和研究骨質(zhì)病變最為普遍的技術(shù)手段之一[1]。20世紀(jì)70年代中期，骨掃描代替了X射線用以研究骨質(zhì)病變，它能夠比X射線提早幾個(gè)月探測(cè)到某些骨質(zhì)病變的發(fā)生。Subramanian等[2]對(duì)99Tcm-MDP和其它99Tcm標(biāo)記的骨顯像劑進(jìn)行了詳細(xì)的對(duì)比，認(rèn)為99Tcm-MDP用于骨顯像效果最佳。然而99Tcm-MDP作為骨顯像劑也存在不足之處，比如給藥后2～6 h，骨掃描效果才比較好[3]。縮短給藥后掃描等待時(shí)間可以減輕病人的負(fù)擔(dān)，這就要求放射藥物對(duì)骨質(zhì)有更高的親和力。在其后30多年里，科研工作者不斷將雙膦酸結(jié)構(gòu)優(yōu)化后進(jìn)行99Tcm標(biāo)記，以發(fā)展性能優(yōu)異的新型骨顯像劑[1,3-4]。

雙膦酸以含P—C—P鍵為特征，側(cè)鏈由R1和R2構(gòu)成。改變兩個(gè)側(cè)鏈R1和R2的結(jié)構(gòu)，極大地豐富了雙膦酸的結(jié)構(gòu)，為尋求更優(yōu)秀的雙膦酸提供了可能。側(cè)鏈R1和R2決定了雙膦酸的藥理特性[5-7]。R1為羥基，提高了雙膦酸對(duì)骨質(zhì)的親和力。R2的性質(zhì)對(duì)于提高雙膦酸抑制骨再吸收能力至關(guān)重要。R2為含氮氨烷基或含氮雜環(huán)、R1為羥基的雙膦酸的治療效果更好。帕米膦酸(pamidronate)的烷基鏈上有1個(gè)伯胺氮原子，其效能是不含氮原子的依替膦酸(etidronate)效能的10到100倍[6]。大多數(shù)的第三代雙膦酸R2為含有1個(gè)或2個(gè)氮原子的雜環(huán)。唑來(lái)膦酸(1-羥基-2-(1H-咪唑-1-基)乙烷-1,1-雙膦酸,Zoledronic acid)是目前綜合治療效果最佳的雙膦酸，它的效能至少是帕米膦酸的100倍或者是依替膦酸的1 000倍[8]。

為了尋找新型品優(yōu)雙膦酸骨顯像劑，本課題組進(jìn)行了大量嘗試，陸續(xù)制備了99Tcm標(biāo)記的雙膦酸，包括99Tcm-ZL[9]、99Tcm-MIDP[10]、99Tcm-EIDP[11]、99Tcm-PIDP[12]和99Tcm-EMIDP[13]，探索了它們作為骨顯像劑的可能性。結(jié)果表明，這些標(biāo)記物有良好的生物學(xué)性質(zhì)，注射藥物后1～2 h可以給出清晰的全身兔骨顯像，是潛在的骨顯像劑。為了尋找新型性能更加優(yōu)異的骨顯像劑，本工作擬合成一種新型雙膦酸，即1-羥基-2-(1-丁基-1H-咪唑-2-基)亞乙基-1,1-雙膦酸(HBIDP)，并用99Tcm進(jìn)行標(biāo)記，測(cè)定99Tcm-HBIDP的脂水分配系數(shù)和血漿蛋白結(jié)合率，比較99Tcm-HBIDP與99Tcm-ZL小鼠體內(nèi)分布的差異。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

1-丁基咪唑(純度為99%)，上海邦成化工有限公司；其他試劑均為分析純，無(wú)需提純，可直接使用，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

Yanaco MP-500熔點(diǎn)儀，日本島津公司；Elementar Varil EL Ⅲ型元素分析儀，德國(guó)Elementar公司；TENSOR27型傅里葉變換紅外光譜儀,德國(guó)Bruker光譜儀器公司；Waters Platform ZMD4000型質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司；Bruker DRX-500型核磁共振儀,德國(guó)Bruker光譜儀器公司；Waters 600型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；HPLC柱，SinoChrom ODS-BP，PN:E2117215-080108，4.6 mm×250 mm×10 μm，大連依利特分析儀器有限公司，Cd(Te)檢測(cè)器，美國(guó)Perkin Elmer公司；PackardCobra型自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器，美國(guó)Victoreen公司。

ICR小鼠，18～20 g,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 1-羥基-2-(1-丁基-1H-咪唑-2-基)亞乙基-1,1-雙膦酸(6)(HBIDP)的合成

按圖1所示，原料1-丁基咪唑(1)經(jīng)五步反應(yīng)，合成了目標(biāo)化合物1-羥基-2-(1-丁基-1H-咪唑-2-基)亞乙基-1,1-雙膦酸(6)。詳細(xì)合成方法參見文獻(xiàn)[14-15]。

圖1 HBIDP的合成路線

1.3 99Tcm-HBIDP的制備

配體溶液的配制：將250 mg HBIDP加入到5 mL 0.02 mol/L NaOH溶液中使之溶解，其質(zhì)量濃度為50 g/L，pH≈6。

SnCl2·2H2O溶液的配制：準(zhǔn)確稱量10 mg SnCl2·2H2O置于干凈的西林瓶中，加入0.5 mol/L HCl 10 mL，將其溶解完全，其質(zhì)量濃度為1 g/L。此溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

向10 mL西林瓶中依次加入一定體積的50 g/L雙膦酸鈉鹽溶液、一定體積的1 g/L SnCl2·2H2O鹽酸溶液，一定量的Na99TcmO4溶液，再加入pH=6的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，控制總體積為2 mL，渦旋振蕩器充分振蕩混勻，室溫(25±1)℃下反應(yīng)一定時(shí)間即標(biāo)記完畢。

1.4 標(biāo)記率和放化純的測(cè)定方法

1.5 最佳標(biāo)記條件的選擇

1.5.1pH值對(duì)放化純的影響 向12個(gè)西林瓶中各加入100 μL 50 g/L HBIDP的鈉鹽溶液、100 μL 1 g/L SnCl2·2H2O的鹽酸溶液、55.5 MBq新鮮淋洗的Na99TcmO4洗脫液，分別用pH為1至12的磷酸鹽緩沖液將其定容至2 mL，渦旋混合器充分混勻后開始計(jì)時(shí)，室溫(25±1)℃下反應(yīng)20 min用TLC法測(cè)定各個(gè)體系的放化純。

1.5.4配體用量對(duì)放化純的影響 向10個(gè)西林瓶中分別加入含有2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、8.0、10.0 mg HBIDP的鈉鹽溶液，再逐個(gè)加入100 μL 1 g/L SnCl2·2H2O的鹽酸溶液，新鮮淋洗的Na99TcmO4洗脫液55.5 MBq，用pH=6的磷酸鹽緩沖液將其定容至2 mL，渦旋混合器充分混勻后開始計(jì)時(shí)，室溫(25±1)℃下反應(yīng)20 min后用TLC法測(cè)定各個(gè)體系的放化純。

1.5.5反應(yīng)時(shí)間對(duì)放化純的影響 向西林瓶中加入100 μL 50 g/L HBIDP的鈉鹽溶液，100 μL 1 g/L SnCl2·2H2O的鹽酸溶液，新鮮淋洗的Na99TcmO4溶液(55.5 MBq)，用pH=6的磷酸鹽緩沖液將其定容至2 mL，渦旋混合器充分混勻后開始計(jì)時(shí)，室溫(25±1)℃下反應(yīng)，在30 min之內(nèi)，每5 min取樣1次測(cè)定不同時(shí)間下的放化純。

1.6 脂水分配系數(shù)

將磷酸鹽緩沖液與正辛醇超聲振蕩混合，使兩相互相飽和后分離貯存?zhèn)溆谩?/p>

取2支放敏管，編為1號(hào)與2號(hào)，向二者均加入飽和的1.0 mL正辛醇和1.0 mL磷酸鹽緩沖溶液，其中向1號(hào)管所加磷酸鹽緩沖液pH=7.0，向2號(hào)管所加磷酸鹽緩沖液pH=7.4，然后向兩支管中均加入100 μL99Tcm-HBIDP溶液(約1.85 MBq)，室溫下渦旋混合器混合振蕩2 min，然后離心5 min(4 000 r/min)，以保證兩相完全分離，兩相各取100 μL測(cè)其放射性計(jì)數(shù)。計(jì)算脂水分配系數(shù)lgP=lg(有機(jī)相放射性計(jì)數(shù)/水相放射性計(jì)數(shù))。

1.7 血漿蛋白結(jié)合率

分別配制質(zhì)量濃度為100 g/L和250 g/L的三氯乙酸；取新鮮肝素抗凝血漿2 mL(江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所附屬江原醫(yī)院提供)，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取3支放敏管，各加入100 μL血漿和100 μL99Tcm-HBIDP溶液(約55.5 kBq)，37 ℃水浴孵育2 h。給每管加入250 g/L三氯醋酸1 mL，以使血漿蛋白沉淀。上層清液和沉淀離心分離5 min(2 000 r/min)，收集上清液。向沉淀中加入100 g/L的三氯醋酸1 mL，渦旋混合器混勻，離心5 min(2 000 r/min)，收集上清液。此步驟重復(fù)操作3次。分別測(cè)定沉淀的放射性計(jì)數(shù)和上清液的放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率=沉淀物放射性計(jì)數(shù)/(沉淀物放射性計(jì)數(shù)+上清液放射性計(jì)數(shù))×100%。

1.8 99Tcm-HBIDP在小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)

ICR小鼠35只，隨機(jī)分為7組，每組5只，每只小鼠尾靜脈注射200 μL新配制的99Tcm-HBIDP(約7.4 MBq)，分別于注射后5、10、15、30、60、120、240 min時(shí)斷頸處死，先用一次性定量采血管取200 μL頸動(dòng)脈血液，后解剖取心、肝、脾、肺、腎、大腿骨、關(guān)節(jié)、肌肉、腦等組織，稱重，用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的放射性計(jì)數(shù)，分別計(jì)算各臟器每克組織的攝取量(%ID/g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 HBIDP的合成

HBIDP的合成反應(yīng)前半步屬于膦?；磻?yīng)，三氯化磷對(duì)于反應(yīng)的順利進(jìn)行十分必要，沒(méi)有三氯化磷反應(yīng)不能進(jìn)行[16]。該反應(yīng)是一個(gè)強(qiáng)烈的放熱反應(yīng)，同時(shí)放出大量氯化氫氣體。當(dāng)三氯化磷加入速度過(guò)快時(shí)，體系內(nèi)溫度快速升高，反應(yīng)異常劇烈，瞬間產(chǎn)生大量氣體，容易造成危險(xiǎn)，同時(shí)造成產(chǎn)物產(chǎn)率低下。通過(guò)控制三氯化磷的滴加速度和加料時(shí)油浴溫度(70～80 ℃)，既可以使反應(yīng)較快進(jìn)行，又不致因反應(yīng)劇烈放熱和放出氣體使體積迅猛膨脹而發(fā)生危險(xiǎn)，從而保證了反應(yīng)平穩(wěn)順利進(jìn)行。由于該反應(yīng)是非均相反應(yīng)，產(chǎn)率一般在40%～60%[7]。據(jù)文獻(xiàn)[17]報(bào)道，若用甲磺酸做溶劑，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程保持均相反應(yīng)，收率可達(dá)到90%，但后處理不如用氯苯簡(jiǎn)單方便，且后者更廉價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)所得目標(biāo)物HBIDP，收率：50.0%;熔點(diǎn)：140～145 ℃；元素分析：實(shí)測(cè)值(理論值)C 32.89%(32.94%),H 5.61%(5.53%),N 8.49%(8.54%);IR(KBr,cm-1):3 155(s),2 962(s),2 875(s),2 318(br,w),1 598(m),1 520(m),1 467(w),1 164(s),985(s);ESI-MS,m/z(%):329(100)=M+1;1H NMR(400 MHz,D2O，δ):7.31(d,1H,ring-H),7.26(d,1H,ring-H),4.21(t,2H,N—CH2),3.58(t,2H,JH-P=12 Hz,CH2C—P),1.81(m,2H,N—CH2CH2),1.32(m,2H,—CH2CH3),0.91(t,3H,—CH3)。

2.2 99Tcm-HBIDP的放射化學(xué)純度

圖2 Na99TcmO4(a)和99Tcm-HBIDP(b)的HPLC譜圖分析

2.3 最佳標(biāo)記條件

圖3 pH對(duì)99Tcm-HBIDP放化純的影響

2.3.1pH值對(duì)放化純的影響結(jié)果 pH對(duì)放化純的影響示于圖3。從圖3可以看出，放化純對(duì)體系pH值變化很敏感。pH≈6時(shí)，放化純最高，達(dá)到95%以上；pH大于7或小于2時(shí)，放化純急劇下降，并小于90%。氯化亞錫在中性水溶液易分解生成沉淀，與堿作用生成水和氧化物沉淀，但堿量過(guò)剩時(shí)，生成能溶解的亞錫酸鹽，均會(huì)使還原性大大降低甚至消失。但酸性太強(qiáng)時(shí)，放化純也會(huì)明顯下降。這可能是因?yàn)閺?qiáng)酸性條件下，大量質(zhì)子存在抑制了配位反應(yīng)的發(fā)生。據(jù)此，選擇pH=6作為標(biāo)記反應(yīng)條件。

圖4 氯化亞錫用量對(duì)99Tcm-HBIDP放化純的影響

圖5 活度對(duì)99Tcm-HBIDP放化純的影響

圖6 配體用量對(duì)99Tcm-HBIDP放化純的影響

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)99Tcm-HBIDP放化純的影響

2.3.5反應(yīng)時(shí)間對(duì)放化純的影響 反應(yīng)時(shí)間(treac)對(duì)放化純的影響示于圖7。從圖7可以看出，時(shí)間對(duì)放化純的影響較小。1 min內(nèi)放化純已達(dá)90%，說(shuō)明此反應(yīng)十分迅速。15 min時(shí)RCP已達(dá)95%，時(shí)間再延長(zhǎng)，標(biāo)記率略有上升。為了縮短制備放射藥物的時(shí)間，15 min已經(jīng)可以滿足使用要求。

2.4 99Tcm-HBIDP的體外穩(wěn)定性

標(biāo)記物良好的體外穩(wěn)定性是放射性藥物能被應(yīng)用的前提。將99Tcm-HBIDP置于室溫(25±1)℃下，分別于標(biāo)記后1、2、3、4、5、6 h時(shí)取樣測(cè)定放化純。其結(jié)果示于圖8。由圖8可知，6 h時(shí)放化純大于90%，這說(shuō)明99Tcm-HBIDP的體外穩(wěn)定性較好，滿足使用要求。

圖8 99Tcm-HBIDP的體外穩(wěn)定性

2.5 99Tcm-HBIDP的脂水分配系數(shù)

99Tcm-HBIDP在pH為7.0和7.4時(shí)，脂水分配系數(shù)lgP分別為-2.17和-2.28，表現(xiàn)出很強(qiáng)的親水性。對(duì)骨顯像藥物而言，親水性越好，單位質(zhì)量的藥物在軟組織中的吸收將會(huì)相對(duì)下降，靶向組織(骨骼)中的攝取相對(duì)增加，有利于發(fā)揮藥物的顯像作用。

2.6 99Tcm-HBIDP的血漿蛋白結(jié)合率

99Tcm-HBIDP的血漿蛋白結(jié)合率為(31.41±1.25)%。99Tcm-ZL血漿蛋白結(jié)合率為17.40%[9]。前者血漿蛋白結(jié)合率高于后者，可能是分子中含有親脂性丁基，增加了其與蛋白的結(jié)合能力，從而使其血漿蛋白結(jié)合率增大。

2.7 99Tcm-HBIDP在小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)

99Tcm-HBIDP小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1。從表1可以看出，99Tcm-HBIDP主要集中在骨、關(guān)節(jié)和腎中，并且在骨中有高度選擇性的攝取。99Tcm-HBIDP在注射5 min后，在骨和關(guān)節(jié)中的攝取分別達(dá)到了(4.76±0.37)%ID/g和(11.55±0.85)%ID/g,并且逐漸增加，在30 min時(shí)達(dá)到最高，分別為(9.07±0.97)%ID/g和(30.12±2.36)%ID/g。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其在骨和關(guān)節(jié)中的吸收有所下降，但是在240 min時(shí)仍分別高達(dá)(6.83±0.14)%ID/g和(18.96±1.87)%ID/g，而藥物在心、肝、脾、肺等器官組織中已經(jīng)基本清除完畢。99Tcm-HBIDP在腎臟和血液中的攝取隨時(shí)間延長(zhǎng)而快速下降，表明此藥物主要經(jīng)過(guò)腎臟代謝，經(jīng)由泌尿系統(tǒng)排出體外。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，骨攝取與心、肝、脾、肺、血液中攝取的比值快速升高，有利于降低顯像本底，提高骨顯像質(zhì)量。圖9給出了99Tcm-HBIDP和99Tcm-ZL(其小鼠分布數(shù)據(jù)可參考文獻(xiàn)[9])不同時(shí)刻骨、心、肝和脾器官組織中的攝取值的對(duì)比。前者在骨中攝取60 min內(nèi)高于后者。在240 min內(nèi)99Tcm-HBIDP在心、肝和脾器官組織中的攝取遠(yuǎn)低于99Tcm-ZL，表明99Tcm-HBIDP對(duì)這些重要臟器的傷害較小?？傊?，99Tcm-HBIDP有望成為新型骨顯像劑。

表1 99Tcm-HBIDP小鼠體內(nèi)分布

注(Note)：1)量綱為1(Unit is 1)

2)n=5

圖9 99Tcm-HBIDP和99Tcm-ZL不同時(shí)刻的小鼠體內(nèi)分布

3 結(jié) 論

[1]Vbrbeke K,Rozenski J,Cleynhens B,et al.Deve-lopment of a Conjugate of99Tcm-EC With Aminomethylenediphosphosphonate in the Search for a Bone Tracer With Fast Clearance From Soft Tissue[J].Bioconjugate Chem,2002,13 (1): 6-22.

[2]Subramanian G,Mcafee J G,Blair R J,et al.Technetium-99m-Methylene Diphosphonate-A Superior Agent for Skeletal Imaging: Comparison With Other Technetium Complexes[J].J Nucl Med,1975,16 (8): 744-755.

[3]Ogawa K,Mukai T,Inoue Y,et al.Development of a Novel99Tcm-Chelate-Conjugated Bisphosphonate With High Affinity for Bone as a Bone Scintigraphic Agent[J].J Nucl Med,2006,47 (12): 2 042-2 047.

[4]Fogelman I,Pearson D W,Bessent R G,et al.A Comparison of Skeletal Uptakes of Three Diphosphonates by Whole-Body[J].J Nucl Med,1981,22: 880-883.

[5]Russell R G G,Croucher P I,Rogers M J.Bisphosphonates: Pharmacology,Mechanisms of Action and Clinical Uses[J].Osteoporosis Int Suppl,1999,2: S66-80.

[6]Russell R G G,Rogers M J.Bisphosphonates: From the Laboratory to the Clinic and Back Again[J].Bone,1999,25 (1): 97-106.

[7]Widler L,Jaeggi K A,Glatt M.Highly Potent Geminal Bisphosphonates.From Pamidronate Disodium (Aredia)to Zoledronic Acid (Zometa)[J].J Med Chem,2002,45 (17): 3 721-3 738.

[8]Smith M R.Osteoclast Targeted Therapy for Prostate Cancer: Bisphosphonates and Beyond[J].Urol Oncol-Semin Ori,2008,26: 420-425.

[9]Lin Jiangguo,Qiu Ling,Cheng Wen,et al.Preparation andinVivoBiological Investigations on a Novel Radioligand for Bone Scanning: Technetium-99m-Labeled Zoledronic Acid Derivative[J].Nucl Med Biol,2011,38(5): 619-629.

[10]羅世能，王洪勇，謝敏浩，等.99Tcm- MIDP 的制備及其生物學(xué)分布[J].中華核醫(yī)學(xué)雜志，2005,25(6):341-343.

[11]牛國(guó)塞，羅世能，嚴(yán)孝紅，等.99Tcm-EIDP的制備及生物學(xué)分布[J].核技術(shù)，2008,31(9):698-701.

[12]Chen Chuanqing,Luo Shineng,Lin Jianguo,et al.Preparation and Biodistribution of99Tcm-PIDP as Bone Imaging Agent[J].Nucl Sci Technol,2009,20 (5): 302-306.

[13]Lin Jianguo,Luo Shineng,Chen Chuanqing,et al.Preparation and Preclinical Pharmacological Study on a Novel Bone Imaging Agent99Tcm-EMIDP[J].Appl Radiat Isot,2010,68: 1 616-1 622.

[14]南蓓蓓，邱玲，林建國(guó)，等.兩種新型1-烷基咪唑類雙膦酸的合成和表征[J].化學(xué)試劑，33(11)：971-974.

[15]Guo Xuehua,Luo Shineng,Wang Hongyong,et al.Study on the Preparation and Biodistribution of99Tcm-HMIBP[J].Nucl Sci Tech,2006,17 (5): 285-288.

[16]Prentice J B,Quimby O T,Grabenstetter R J,et al.Interaction of Acylating Agents and Phosphorus (Ⅲ)Sources.I.Intermediacy of Condensed Species in the Formation of Ethane-1-Hydroxy-1,1-Diphosphonic Acid[J].J Am Chem Soc,94 (17): 6 119-6 124.

[17]Kieczykowski G R,Jobson R B,Melillo D G.Preparation of (4-Amino-1-Hydroxybutylidene)Bisphosphonic Acid Sodium Salt,MK-217(Alendronate Sodium).An Improved Procedure for the Preparation of 1-Hydroxy-1,1-Bisphosphonic Acids[J].J Org Chem,1995,60 (25): 8 310-8 312.