任曉亮，侯 睿，王 珊，戰(zhàn)淵超，黃曉婷，包振民

（中國海洋大學海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東青島266003）

控制蝦夷扇貝閉殼肌積累類胡蘿卜素相關基因的篩查＊

任曉亮，侯 睿，王 珊，戰(zhàn)淵超，黃曉婷＊＊，包振民

（中國海洋大學海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東青島266003）

利用抑制性差減雜交技術（Suppression subtractive hybridization，SSH）對蝦夷扇貝閉殼肌積累類胡蘿卜素相關基因進行篩查和分析。以蝦夷扇貝橘紅色閉殼肌和白色閉殼肌cDNA構建正反向差減文庫，結合454測序技術在正向差減文庫中測序得到2 640條序列，拼接得到50個contigs（重疊群）；反向差減文庫中測序得到2 496條序列，拼接得到187個contigs。經過同源性比對分析，共獲得150多個差異表達基因，從中選擇3種清道夫受體SRB1、SRF2和SRCR作為候選基因進行研究，對其在蝦夷扇貝各組織中的表達量水平進行檢測，初步闡述了其在蝦夷扇貝中的組織表達規(guī)律。根據結果推測在蝦夷扇貝橘紅色閉殼肌中，清道夫受體有可能是調節(jié)類胡蘿卜素累積和轉運的關鍵基因。本研究為蝦夷扇貝閉殼肌類胡蘿卜素累積相關通路的探索提供了初步研究的基礎數據。

蝦夷扇貝；閉殼??；類胡蘿卜素；抑制性差減雜交

蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）是我國從日本引種的重要海水養(yǎng)殖貝類［1］。2003年中國海洋大學課題組在蝦夷扇貝野生群體里發(fā)現了一種顏色突變體蝦夷扇貝，約占群體總數0.2%，其閉殼肌呈鮮艷的橘紅色而不是普通的白色，研究表明造成這一變異主要是由于橘紅色閉殼肌扇貝的肉柱中積累了大量的類胡蘿卜素［2］。隨后課題組開展了選育工作，育成了閉殼肌富含類胡蘿卜素的“海大金貝”（品種登記號：GS－01－002－2009）。研究發(fā)現，閉殼肌內累積類胡蘿卜素是穩(wěn)定遺傳的質量性狀。但是，這種類胡蘿卜素的累積的機理如何？有哪些基因在這一過程中起了關鍵作用？目前并不清楚，需要進一步研究。

抑制性差減雜交（Suppression subtractive hybridization，簡稱SSH）技術自Diatchenko［3］等建立以來，已在水稻［4］、小麥［5－6］、玉米［7］、大鼠［8］、豬［9］以及人［10］等多種生物的差異基因分離中得到應用，被認為是有效富集差異表達基因的方法之一［11］。本研究利用SSH法對蝦夷扇貝閉殼肌顏色差異相關基因進行篩選和分析。以“海大金貝”橘紅色閉殼肌（簡稱紅柱）和白色閉殼?。ê喎Q白柱）c DNA為材料構建SSH文庫，結合454測序技術對篩選得到的特異性cDNA進行測序，分析閉殼肌內可能與類胡蘿卜素累積相關的基因的功能，為深入了解蝦夷扇貝閉殼肌類胡蘿卜素累積相關機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蝦夷扇貝取自大連獐子島漁業(yè)有限公司，分別取15只3齡紅柱和白柱蝦夷扇貝的閉殼肌組織，液氮冷凍，－80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 蝦夷扇貝閉殼肌總RNA的提取及m RNA的分離純化 分別取紅柱與白柱蝦夷扇貝的閉殼肌組織，按常規(guī)的異硫氰酸胍法［12］裂解提取總RNA。隨后用Oligotex m RNA Purification Kit（Qiagen公司）分離和純化m RNA。

1.2.2 蝦夷扇貝閉殼肌組織cDNA的抑制性差減雜交

具體操作按照PCR－Select TM cDNA Subtraction Kit（Clontech公司）說明書進行。首先分別取紅柱與白柱蝦夷扇貝mRNA各2μg合成雙鏈cDNA，然后分別經RsaⅠ酶切消化。正向差減雜交以蝦夷扇貝紅色肉柱cDNA為tester（測試組），白色肉柱cDNA為driver（驅動組）；反之設為反向差減雜交。按照Clontech公司的試劑盒操作說明，經過68℃8和20 h 2輪差減雜交后，再進行2輪抑制性PCR以獲得特異性擴增的cDNA片段。

1.2.3 差異片段的測序與分析 將2輪抑制性PCR后獲得的特異性擴增的cDNA進行純化回收，加標識個體或組織的barcode接頭，將所有產物混合后，利用羅氏454 GS FLX進行測序，將獲得的序列信息去除接頭序列后，利用CAP3軟件進行序列拼接，而后利用NCBI的Blastx軟件對序列進行同源性比對及功能注釋。對2個文庫中篩選到的序列的數目差異進行顯著性檢驗。

1.2.4 清道夫受體的組織表達分析 對454測序表達差異顯著的3種清道夫受體SRB1、SRF2和SRCR作為研究對象，分別取蝦夷扇貝紅柱個體與白柱個體外套膜、腮絲、性腺、腎、閉殼肌以及肝胰腺組織，按常規(guī)的異硫氰酸胍法［12］裂解提取總RNA，采用實時熒光定量PCR技術，檢測蝦夷扇貝不同組織中清道夫受體的表達情況，用2－△△CT法對實驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 蝦夷扇貝閉殼肌組織RNA的提取質量

圖1 白柱與紅柱蝦夷扇貝閉殼肌總RNA檢測結果Fig.1 Electrophoresis of total RNA extracted from the white and orange adductor muscles of P.yessoensis

圖1所示為經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測的白柱與紅柱蝦夷扇貝閉殼肌組織提取的總RNA。28S RNA、18S RNA亮度的比值約為1∶2，條帶清晰表明總RNA具有較好的完整性，基本沒有降解的情況。本實驗利用紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，結果表明實驗選取的白柱和紅柱蝦夷扇貝閉殼肌的總RNA的OD260nm／OD280nm比值分別是1.96和1.98，證明本實驗提取的總RNA質量較高，基本沒有雜質污染，并且總RNA濃度滿足試劑盒的要求。

2.2 抑制性差減雜交產物的檢測

抑制性差減雜交產物經過2次特異性PCR擴增之后電泳結果如圖2所示。

圖2 正反向差減文庫差減雜交產物第二輪PCR擴增結果Fig.2 Electrophoresis of SSH products of the forward and reverse subtracted libraries amplified after two rounds of PCR

正反向差減文庫的差減雜交產物在經過2次特異性PCR后得到了擴增，電泳結果為一段彌散的cDNA smear，片斷大小主要集中在250～750 bp之間，較大的片斷得到了明顯的消減。

2.3 cDNA差減文庫的構建及差減效率檢測

將抑制差減雜交cDNA的第2次抑制性擴增產物純化回收，構建了正反向差減文庫。通過對文庫中的克隆進行PCR檢測，顯示文庫中的插入片段大小主要隨機分布在250～750 bp之間，部分克隆的PCR電泳結果如圖3和4所示。另外對整個抑制性差減雜交流程進行差減效率檢測，分別以差減c DNA與未差減cDNA為模板對持家基因β－actin進行擴增，在第18、23、28、33、38個循環(huán)時從體系中取出7μL擴增產物進行電泳檢測。未消減cDNA在18～23個循環(huán)后就有β－actin擴增條帶出現，而消減cDNA在33個循環(huán)后才有β－actin擴增條帶出現，該結果說明2次差減雜交過程中的消減效率較高，所構建的正反向差減文庫質量較好。

圖3 正向差減文庫插入片段的檢測結果Fig.3 Identification of the inserted cDNA fragments in the forward subtracted library

圖4 反向差減文庫插入片段的檢測結果Fig.4 Identification of the inserted cDNA fragments in the reverse subtracted library

2.4 差減雜交產物的測序及分析

利用454測序技術對篩選得到的特異性cDNA進行測序分析，統計結果見表1。

表1 蝦夷扇貝正反向差減文庫序列數目統計Table 1 Quantities of sequences of the forward and reverse subtracted libraries of P.yessoensis

正向差減文庫測序得到2 640條序列，拼接得到50個contigs（重疊群），其中14個表達量超過平均值，占28%；反向差減文庫測序得到2 496條序列，拼接得到187個contigs，其中57個表達數目明顯多于平均值，占總數的30%。從正反向差減文庫得到的454讀取的片段數目大致相同可以看出兩文庫構建的標準統一，結果具有可比性，其后續(xù)拼接的contigs的數目差異和種類差異主要是由基因表達的差異造成的。

對表達明顯變化的基因片段對NCBI的genbank數據庫同源性比對，紅柱特異性序列中獲得了清道夫受體，緊密連接蛋白、錨蛋白、錳超氧化物歧化酶、磷酸葡萄糖變位酶等共27種基因，涉及脂類代謝，滲透調節(jié)、細胞連接、肌肉運動、活性氧清除等方面，部分結果如表2所示；白柱特異性序列中獲得了多聚泛素、PDZ結構域蛋白、溶質載體等共121種基因，涉及蛋白降解，信號傳遞，轉錄調控等方面，部分結果如表3所示。

表2 正向差減文庫cDNA片段同源比對結果（P＜0.05）Table 2 BLAST results of forward subtracted cDNA library（P＜0.05）

表3 反向差減文庫cDNA片段同源比對結果（P＜0.05）Table 3 BLAST Results of reverse subtracted cDNA library（P＜0.05）

2.5 清道夫受體基因的組織表達分析

通過差異顯著性檢驗，篩選得到的3種清道夫受體基因的序列豐度在紅白柱蝦夷扇貝之間存在顯著差異，清道夫受體基因SRB1，SRF2和SRCR在紅白柱蝦夷扇貝各組織中的表達量檢測結果分別如圖5～7所示。

SRB1在肝胰腺中的表達量最高，在性腺中的表達量次之，在外套膜，腮，腎以及閉殼肌中的表達量均較低。SRB1分別在雄性紅白柱蝦夷扇貝中的表達量相似。在雌性性腺和閉殼肌組織中，紅柱蝦夷扇貝SRB1表達量顯著高于白柱蝦夷扇貝。

SRF2在性腺和腎中的表達量明顯高于其他組織，且在腎中的表達量最高。在雌性腎組織中，紅柱蝦夷扇貝SRF2表達量高于白柱蝦夷扇貝，在雌性閉殼肌組織中，紅柱蝦夷扇貝SRF2表達量顯著高于白柱蝦夷扇貝。在雄性性腺中，紅柱蝦夷扇貝SRF2表達量顯著低于白柱蝦夷扇貝。

SRCR在肝胰腺中的表達量最高，且明顯高于其他組織，在紅柱蝦夷扇貝中的表達量高于白柱蝦夷扇貝。SRCR在性腺和肝胰腺中也有較高的表達量，在雌性性腺中，紅柱蝦夷扇貝SRCR表達量高于白柱蝦夷扇貝，在雄性性腺中，紅柱蝦夷扇貝SRCR表達量低于白柱蝦夷扇貝。在雌性閉殼肌組織中，紅柱蝦夷扇貝SRCR表達量顯著高于白柱蝦夷扇貝。

圖7 蝦夷扇貝各組織SRCR表達量檢測結果Fig.7 Real－time PCR results of SRCR in tissues of P.yessoensis

3 討論

3.1 正反向差減文庫的構建

作為一種高效的分離差異表達基因的方法，SSH技術篩選差異基因的陽性率可達94%［13］。在實際應用中，SSH最顯著的特點在于應用2次差減雜交和2次PCR擴增［14］，消除了c DNA群體中各分子間豐度的差異，使低豐度表達基因得到富集［15］，提高了篩選得到低豐度表達基因的可能性。本研究將SSH技術與454測序技術相結合，省去了常規(guī)的連接轉化挑取克隆等步驟，大大簡化了實驗流程，同時利用454測序技術的高通量等特點，可以獲得絕大部分篩選得到的特異性序列的信息，進一步提高了得到低豐度表達基因的可能性。在測序過程中，表達豐度不同的特異性序列測序深度不同，直接反映了它們在表達量上的差異，為后續(xù)實驗篩選候選基因提供了依據。

本研究在正向抑制性差減雜交cDNA文庫中，篩選得到了鐵蛋白（Ferritin），鐵蛋白是普遍存在于生物體內的一種保守性較高的多功能多亞基蛋白，它不僅調節(jié)體內鐵的含量，而且在抵抗氧化損害、調節(jié)細胞增殖等方面發(fā)揮了重要作用，且和機體的免疫反應有一定的相關性［16］。在一定范圍內，隨著體內鐵離子含量的增加，體內自由基含量增加，可以氧化低密度脂蛋白（LDL）形成氧化－LDL（ox－LDL）［17］，推測鐵蛋白有可能通過調控體內鐵離子的含量來影響低密度脂蛋白的水平，進而影響到類胡蘿卜素在體內的轉運過程。

在反向抑制性差減雜交cDNA文庫中，篩選得到了多聚泛素（Polyubiquitin）等基因。多聚泛素由多個泛素單體首尾相連而形成，可以被特殊的蛋白酶消化為泛素單體［18］。泛素－蛋白酶體途徑是細胞內ATP依賴的蛋白質選擇性降解的主要途徑，參與細胞凋亡、抗原呈遞、細胞周期以及細胞內信號轉導等多種生理過程［19］，其對靶蛋白的降解是一種級聯反應過程［20］。在哺乳動物細胞中泛素系統被認為參與了幾種膜蛋白的內化和下調，如上皮鈉通道（ENaC）、生長激素受體（GHR）、表皮生長因子受體（EGFR）、集落剌激因子／受體和某些免疫系統受體［21］。在酵母細胞中，泛素可能作為一種內化信號直接與胞吞系統相互作用［22］。研究表明，泛素－蛋白酶體途徑可能參與了內化后受體到溶酶體的轉運［23－25］，而在溶酶體內降解的低密度脂蛋白受體相關蛋白（LDL receptor－related protein，LRP）也發(fā)現有類似的結果，低密度脂蛋白正是轉運類胡蘿卜素的重要載體之一，因此推測蛋白酶體可能參與下調類胡蘿卜素的累積。

本實驗室利用蛋白質雙向電泳技術對橘紅色閉殼肌與白色閉殼肌中的蛋白質成分進行比較，并對橘紅色閉殼肌中特異性表達的蛋白質進行質譜分析（未發(fā)表），篩選得到了7種蛋白，分別是延伸因子－β（Elongation factor 1－beta）、蛋白酶體亞基（Proteasome subunit alpha type－1）、果糖二磷酸醛縮酶（Fructose－bisphosphate aldolase）、過氧化物輔酶A異構酶（Peroxisomal 3，2－trans－enoyl－Co A isomerase）、T－復合物多肽1（TCP1）、微管蛋白（Tubulin）以及鐵蛋白（Ferritin）。將這一結果與本研究進行比較，其中Fructose－bisphosphate aldolase、Tubulin、Ferritin在正向差減文庫中均有發(fā)現，而Elongation factor 1－beta在反向差減文庫中有發(fā)現，其余3種蛋白在正反向差減文庫中均沒有發(fā)現。比較發(fā)現在差減文庫中篩選得到的特異性序列，在其他實驗也可以篩選得到，說明本實驗所采用的抑制性差減雜交技術是比較穩(wěn)定可靠的。在七種蛋白當中有一些蛋白沒有在差減文庫中篩選到，作者認為這一現象的產生首先是由于454測序過程中要將cDNA進行片斷化處理，因此測序得到的并不是全長的片段，這樣通過序列比對，差減文庫中的短基因片段由于同源區(qū)段過短可能無法得到注釋。其次，這種差異有可能代表了橘紅色閉殼肌和白色閉殼肌在轉錄組水平以及蛋白質水平上的表達差異，其中有3種蛋白在2個實驗中均被篩選出來，可以推測這3種蛋白在2種組織中的表達量確實存在著明顯差異，也有可能與類胡蘿卜素的累積有關。另外4種蛋白的篩選結果與差減文庫篩選的結果有所不同，可能是由于同一基因的cDNA的表達水平與蛋白的表達水平可能存在差異，蛋白檢測的結果對于本研究提供了一定的補充，為類胡蘿卜素累積機理的研究提供了更多的候選基因。

根據正反向差減文庫的序列數量分布情況，可以看出，正反向差減文庫最終得到的序列數目大體相似，但其中的特異表達基因在數量分布上呈現不同的趨勢。正向差減文庫的特異表達基因在數量分布上相對集中，均值比較高，而反向差減文庫的特異表達基因在數量分布上則相對離散，均值比較低，推測橘紅色閉殼肌與白色閉殼肌蝦夷扇貝在轉錄組水平上有著比較大的差異，這種差異的產生有可能是導致類胡蘿卜素累積的原因，也有可能是受類胡蘿卜素累積影響而產生的代謝結果，因此還需要進一步的研究來加以證實。

本研究從正反向差減文庫同源比對結果中選取了幾個具有代表性的差異表達基因，對它們的組織表達規(guī)律進行了研究，但更多差異表達基因的組織表達規(guī)律，在蝦夷扇貝閉殼肌類胡蘿卜素累積過程中如何發(fā)揮作用等問題還需要進一步的研究探索。此外，在同源比對結果中還得到了一些未知功能的高拷貝數的新序列，因為在Gene bank中沒有找到相應的同源基因，所以這些序列是否涉及一些尚未被研究認識的扇貝特異性功能，也需要進一步的研究驗證。

3.2 清道夫受體的組織表達規(guī)律

本研究根據測序數據中基因的豐度水平對這些基因的差異顯著性進行分析，發(fā)現SRB1、SRF2以及SRCR這3種清道夫受體的序列豐度在紅白柱蝦夷扇貝之間存在顯著差異。在果蠅（Drosophila）的研究中，Cornelia Kiefer等人發(fā)現nina D基因編碼一種B族清道夫受體，該受體與哺乳動物中發(fā)現的B族1型清道夫受體（SRB1）有著很高的同源性，該受體位于細胞膜的表面，類胡蘿卜素在轉運過程中首先要與高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）結合，形成類胡蘿卜素蛋白復合物，該復合物被位于細胞膜上的清道夫受體所識別，并進一步通過其介導進入胞內，因此清道夫受體在組織細胞吸收類胡蘿卜素的過程中起著關鍵性的作用［26］。推測在蝦夷扇貝橘紅色閉殼肌類胡蘿卜素累積和轉運的過程中，清道夫受體具有類似的功能，有可能是調節(jié)類胡蘿卜素吸收的關鍵基因。相對于其他候選基因，如鐵蛋白，多聚泛素等，清道夫受體的調節(jié)作用更為直接明顯，因此，選擇3種清道夫受體基因作為首選的候選基因進行后續(xù)的研究。

在性腺中，SRB1在雌雄個體間的表達量差異很大，在雌性個體中的表達量高于雄性個體，在雌性性腺中，SRB1在紅柱蝦夷扇貝中的表達量顯著高于白柱蝦夷扇貝，推測原因可能是，在性腺發(fā)育過程中，相比于雄性性腺，雌性性腺中會大量累積類胡蘿卜素，SRB1由于參與類胡蘿卜素的吸收，所以在雌性個體中的表達量要高于雄性個體，同時該結果也暗示紅柱蝦夷扇貝的性腺在吸收類胡蘿卜素方面要強于白柱蝦夷扇貝。SRB1在肝胰腺中的表達量最高，有可能是因為肝胰腺是類胡蘿卜素吸收和轉運較為旺盛的區(qū)域，而SRB1由于起到關鍵的介導作用，表達水平很高。在雌性閉殼肌組織中，SRB1在紅柱蝦夷扇貝中的表達量顯著高于白柱蝦夷扇貝，這一結果與橘紅色閉殼肌中類胡蘿卜素含量顯著高于白色閉殼肌的結果［2］相吻合，推測SRB1在橘紅色閉殼肌吸收轉運類胡蘿卜素的過程中可能起到關鍵作用。在雌性閉殼肌組織中，SRF2和SRCR在紅柱蝦夷扇貝中的表達量顯著高于白柱蝦夷扇貝，這一結果同樣與橘紅色閉殼肌中類胡蘿卜素含量顯著高于白色閉殼肌的結果相吻合，推測SRF2和SRCR同樣在橘紅色閉殼肌吸收轉運類胡蘿卜素的過程中可能起到關鍵作用。

通過上面結果可以發(fā)現，3種清道夫受體結構相似，功能相近，在蝦夷扇貝各組織中的表達規(guī)律存在著相似的地方，比如在肝胰腺和性腺中表達量較高，在雌性閉殼肌組織中，3種清道夫受體在紅柱蝦夷扇貝中的表達量均顯著高于白柱蝦夷扇貝，與橘紅色閉殼肌中類胡蘿卜素含量顯著高于白色閉殼肌的結果相吻合，然而這3種清道夫受體的組織表達規(guī)律仍存在著明顯的不同，這可能與它們具體的功能存在差別有關。

清道夫受體在蝦夷扇貝中的組織表達規(guī)律為揭示橘紅色閉殼肌內類胡蘿卜素累積的原因提供了一定的佐證，但尚無法給出確切的結論，還需要對其做進一步的研究。

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Identification of genes relating to carotenoids accumulation in adductor muscles of Yesso scallops（Patinopecten yessoensis）

REN Xiao－Liang，HOU Rui，WANG Shan，ZHAN Yuan－Chao，HUANG Xiao－Ting，BAO Zhen－Min
（Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Differentially expressed genes relating to carotenoids accumulation in adductor muscle of Yesso scallop（Patinopecten yessoensis）were isolated using suppression subtractive hybridization（SSH）technique.The cDNA of orange and white adductor muscle was used to construct the forward and reverse subtracted libraries.The cDNA fragments differentially expressed in both subtracted libraries were sequenced using 454 sequencing technique.In the forward subtracted library，50 contigs were obtained from 2640 sequences；in the reverse subtracted library，187 contigs were obtained from 2496 sequences.There were more than 150 genes differentially expressed from which three scavenger receptor genes such as SRB1，SRF2 and SRCR were chosen as candidate genes.The analysis of quantitative expression of scavenger receptor genes in all tissues of Yesso scallop was carried out.The results revealed that the scavenger receptors may play a key role in mediating the cellular uptake of carotenoids in Yesso scallops.The results provided preliminary foundation for exploring the pathway of carotenoids accumulation.

Patinopecten yessoensis；adductor muscle；carotenoid；SSH

S197

A

1672－5174（2012）09－041－07

國家自然科學基金項目（31072190；31130054）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目（2010CB126406）；現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資助

2011－10－27；

2012－06－09

任曉亮（1985－），男，碩士生。E－mail：renxiaoliang0417＠163.com

＊＊通訊作者：E－mail：xthuang＠ouc.edu.cn

責任編輯 朱寶象