張玉榮 王建業(yè) 霍正浩 魏 東 楊一歌 楊 澤

隨著人們生活水平的日益提高，前列腺癌(prostate cancer，Pca)的發(fā)病率日益增加。Pca作為威脅全世界男性泌尿生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，在美國(guó)成年男性中其發(fā)病率已經(jīng)超越肺癌躍居首位［1］，在中國(guó)成年男性的泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)病率中位居第3位［2］。Pca的高發(fā)病率使得人們對(duì)其日益重視。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)Pca進(jìn)行了大量的研究，包括其發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、診斷及治療方法等的研究。對(duì)于病因方面的研究結(jié)果顯示Pca的致病因素尚不十分清楚，可能與種族、遺傳、食物、環(huán)境、性激素等有關(guān)。近期的研究結(jié)果則提示某些基因的突變?cè)赑ca的發(fā)病、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。本文借鑒國(guó)外對(duì)于Pca易感基因位點(diǎn)8q24(rs445114，C;rs620861，T;rs6983267，G;rs1447295，A;rs100001454，T;rs7837688，T)的研究結(jié)果，在中國(guó)北方人群中進(jìn)行相應(yīng)易感基因位點(diǎn)的研究，以探索其與中國(guó)北京漢族人群Pca臨床相關(guān)危險(xiǎn)因素之間的關(guān)聯(lián)性。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 研究對(duì)象:Pca患者來(lái)自衛(wèi)生部北京醫(yī)院泌尿外科的門診和住院患者，共124例，所有病例均經(jīng)病理組織學(xué)確證。對(duì)照人群共138例，篩選自衛(wèi)生部北京醫(yī)院體檢中心的常規(guī)體檢人群，所有入選的對(duì)照均為男性，PSA＜4 ng/mL，并且無(wú)Pca家族史。所有研究對(duì)象均對(duì)該檢測(cè)項(xiàng)目知情同意，并且提供了外周血用于檢測(cè)。

1.1.2 主要試劑:全基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自 Bio Chain公司;Taq DNA聚合酶和dNTP購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;LC-green PLUS飽和熒光染料購(gòu)自美國(guó)Idaho公司。引物由上海生工生物技術(shù)開發(fā)有限公司合成;基因測(cè)序由華大基因測(cè)序部完成。

1.1.3 主要儀器:PCR擴(kuò)增儀為美國(guó) MJ公司的PTC-225型PCR儀;高分辨熔解曲線(HRM)基因突變/基因分型檢測(cè)系統(tǒng)為美國(guó)Idaho公司Lightscanner TMHR-I96;DNA定量分析儀為德國(guó)Eppendorf公司的Biophotometer蛋白/核酸比色儀。凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司的Gel DOC-2000成像系統(tǒng)。離心機(jī)為美國(guó)Beckman公司的Allegra TM 21R型離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取及定量:取EDTA抗凝的受試者外周血0.5ml，用全基因組DNA提取試劑盒抽提DNA，通過(guò)蛋白/核酸比色儀對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行濃度和純度的分析。根據(jù)測(cè)定結(jié)果將樣本DNA稀釋至20μg/μl的工作液置于4℃冰箱。

1.2.2 PCR 反應(yīng):以染色體 8q24 區(qū)(rs445114)為例。從Genebank中查取染色體8q24區(qū)附近的基因序列，引物設(shè)計(jì)通過(guò)Oligo 6.0和primer5.0軟件完成。實(shí)驗(yàn)用引物詳情見表1，寡核苷酸內(nèi)參末端用 C3封閉，以阻止延伸反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系 10μl，其中包含:DNA 模板 1μl，10X PCR，Buffer 1μl，10 mmol/L dNTP 0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.1μl，1X LC-green PLUS 飽和熒光染料1μl，寡核苷酸內(nèi)參0.2μl(高溫寡核苷酸內(nèi)參與低溫寡核苷酸內(nèi)參4個(gè)片段各0.05μl)，去離子水補(bǔ)充總體積至10 μl。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5分鐘后進(jìn)入主循環(huán)，95℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸 60秒，總共35個(gè)循環(huán)，完成后72℃延伸7分鐘。之后進(jìn)行HRM分析之前的變性和復(fù)性處理，程序?yàn)?95℃ 30秒，25℃2分鐘，94℃30秒，24℃ 4分鐘。

表1 PCR的引物序列、退火溫度及其產(chǎn)物長(zhǎng)度

表2 測(cè)序引物序列

1.2.3 HRM檢測(cè):將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物移入HRM專用96孔板內(nèi)，在Lightscanner TMHR-I 96儀上進(jìn)行HRM分析:升溫到45℃時(shí)，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲線，98℃結(jié)束，用LightScanner Call IT軟件對(duì)采集后的曲線進(jìn)行分析，判定基因型(如圖1、圖2)。

圖1 8q24(rs445114)HRM分型的熔解曲線圖

圖2 8q24(rs445114)研究樣本的抽樣測(cè)序圖

1.2.4 測(cè)序驗(yàn)證:根據(jù)HRM分析的不同熔解曲線確定不同的基因型。從所得的不同基因型的樣本中分別隨機(jī)抽取5例樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。需測(cè)序樣本的DNA重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序所用引物為:rs445114，退火溫度為50℃，上游序列為 5′-CAAGCAGTGATCCGTTT-3′，下 游 序 列 為 5′-GCAAGTAAGTGCTAAAATAAAGGTA-3′。

PCR 反應(yīng)體系 50μl:DNA 模板 5μl，10X PCR Buffer 5μl，10mmol/L dNTP 1μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各 0.5μl，去離子水補(bǔ)充總體積至 50μl。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5分鐘后進(jìn)入主循環(huán)，95℃變性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，35個(gè)循環(huán)之后72℃延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物將送至華大基因測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SHEsis軟件進(jìn)行兩組間的等位基因及基因型差異分析。應(yīng)用MDR方法進(jìn)行基因-基因交互作用分析及SPSS16.0進(jìn)行基因環(huán)境交互作用分析。運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)研究樣本的群體代表性，對(duì)照組與病例組間基因型與等位基因的分布用χ2檢驗(yàn);為評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)等位基因和基因型與Pca的相關(guān)性，用比值比(OR)和95%的可信區(qū)間 (95%CI);以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2.結(jié)果

2.1 基因型分析 以 8q24(rs445114)為例:8q24(rs445114)位點(diǎn)分為3種基因型:TT、CC、CT。通過(guò)HRM分型系統(tǒng)分析，可根據(jù)樣本的熔解曲線差異，將所有樣本分為3個(gè)組。三組之間的熔解曲線差異非常明顯(圖1)。在每組中隨機(jī)挑選5例樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，進(jìn)行基因型的確定以及HRM分型結(jié)果準(zhǔn)確性的評(píng)估。HRM分型的結(jié)果與測(cè)序的結(jié)果完全吻合，準(zhǔn)確率為100%，測(cè)序圖見圖2。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)上BLAST比對(duì)，序列完全一致。

2.2 8q24(rs445114，C;rs620861，T;rs6983267，G;rs1447295，A;rs100001454，T;rs7837688，T)基因型與等位基因頻率在Pca患者和正常對(duì)照中的分布 以Hardy-Weinberg平衡法檢驗(yàn)正常對(duì)照組的基因型頻率的分布具有群體代表性(P ＞ 0.05)。8q24(rs445114，C;rs620861，T;rs6983267，G;rs1447295，A;rs100001454，T;rs7837688，T)的三種基因型頻率在Pca組和正常對(duì)照組間的分布無(wú)顯著差異，兩種等位基因頻率在兩組間的分布也無(wú)顯著差異(P＞0.05)。(見表3)

表3 基因型與等位基因頻率在Pca患者和正常對(duì)照中的分布

表3 續(xù)表

2.3 單倍型分析 見表4。

表4 8q24上rs445114，rs620861，rs6983267，rs1447295，rs100001454和rs7837688的單倍型分析

2.4 6個(gè)SNPs的基因型在Pca患者不同年齡、Gleason評(píng)分、PSA濃度及腫瘤分期等的分布(見表5) 攜帶8q24(rs445114，C)TC基因型以及8q24(rs620861，T)TC基因型的人群 Pca易感性與食用洋蔥負(fù)相關(guān)(P1=0.007，OR=0.31，95%CI=0.12 ～0.79;P2=0.005，OR=0.30，95%CI=0.11 ～0.77)，攜帶8q24(rs6983267，G)TG基因型的人群Pca易感性與飲酒正相關(guān) (P=0.007，OR=10.75，95%CI=1.35 ～86.14)，其他位點(diǎn)與Pca的發(fā)病年齡、Gleason評(píng)分、PSA濃度以及腫瘤分期等指標(biāo)均無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05)。

表5 6個(gè)SNPs的基因型與Pca患者不同年齡、Gleason評(píng)分、PSA濃度及腫瘤分期等的關(guān)系

表5 續(xù)表

3.討論

目前關(guān)于Pca發(fā)病機(jī)制的研究有幾個(gè)方向，包括種族、遺傳、食物、環(huán)境、性激素等。本文以易感基因作為主要方面，食物、環(huán)境等臨床相關(guān)危險(xiǎn)因素作為次要方面，對(duì)Pca進(jìn)行多種病因分析。8q24區(qū)域是目前報(bào)道與Pca相關(guān)的較為確切的易感位點(diǎn)，最初在冰島人群中發(fā)現(xiàn)8q24上有與Pca易感性相關(guān)的位點(diǎn)，而后其易感位點(diǎn)在歐美人群中進(jìn)行了復(fù)制，多數(shù)報(bào)道其與Pca具有相關(guān)性。在日本人群的復(fù)制研究報(bào)告中顯示有與8q24(rs6983267)關(guān)聯(lián)的報(bào)道，也有與8q24(rs6983267)非關(guān)聯(lián)的報(bào)道。因此我們有必要在中國(guó)北方人群中進(jìn)行8q24多個(gè)易感位點(diǎn)的研究，觀察這些易感位點(diǎn)是否在中國(guó)北方人群中具有研究意義，為國(guó)內(nèi)Pca的病因?qū)W研究提供參考。

本文選取8q24上6個(gè)位點(diǎn)(rs445114，C;rs620861，T;rs6983267，G;rs1447295，A;rs100001454，T;rs7837688，T)進(jìn)行研究，3種基因型和2種等位基因分析結(jié)果表明對(duì)照人群與患患者群之間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。我們分析可能的原因是:遺傳背景不同，生活環(huán)境有所差異，以及樣本數(shù)目不夠多。具體原因還有待于后來(lái)的科學(xué)工作者們加以實(shí)驗(yàn)證明。8號(hào)染色體的某些特定位點(diǎn)突變與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。尤其是染色體8q24區(qū)的廣泛基因關(guān)聯(lián)研究(GWAS)報(bào)道顯示其與多種癌癥的發(fā)生具有密切聯(lián)系，例如Pca、乳腺癌［3］、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌、慢性淋巴細(xì)胞血液?。?～12］等。到目前為止，以及有報(bào)道超過(guò)14種SNPs在這一區(qū)域與各種不同癌癥的發(fā)生具有關(guān)聯(lián)，甚至有多篇文章還顯示8q24的風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域擁有某種調(diào)控能力。在芯片試驗(yàn)中，眾多癌癥(乳腺癌、膀胱癌等)的8q24風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域上會(huì)富集增強(qiáng)子［13，14］，而且多個(gè)研究組芯片實(shí)驗(yàn)還報(bào)道了 Pca［15，16］和結(jié)腸癌［16，17］的8q24風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域可以促使癌癥基因的表達(dá)?？梢钥闯?q24是多種癌癥研究的熱點(diǎn)區(qū)域，這對(duì)在此區(qū)域內(nèi)進(jìn)行Pca的研究具有一定的指導(dǎo)意義。

一個(gè)疾病的發(fā)生往往是由多種因素引發(fā)的。個(gè)體從胎兒期到以后的成長(zhǎng)過(guò)程中，會(huì)有多種物理化學(xué)生物的因素影響到身體的發(fā)育。遺傳是屬于先天從父母那里繼承來(lái)的不可改變的因素，然而很多具有易感基因的個(gè)體后天并沒有發(fā)病，不具有易感基因的個(gè)體卻發(fā)病，這就要?dú)w功于后天的環(huán)境因素。后天的某些生活習(xí)慣，接觸的某些物理、化學(xué)物質(zhì)等可能抑制或者誘導(dǎo)原癌基因的轉(zhuǎn)變?；蚺c環(huán)境的交互作用分析已經(jīng)逐漸成為科研工作者關(guān)注的熱點(diǎn)?；蚺c環(huán)境的交互作用分析也使得我們更全面的了解疾病的發(fā)生，更好的對(duì)疾病發(fā)生給予解釋。本文選取了部分日常生活中常接觸的物質(zhì)以及一些臨床常規(guī)指標(biāo)對(duì)Pca進(jìn)行了基因與環(huán)境的交互作用分析。分析了6個(gè)SNPs的基因型與Pca患者不同文化程度、是否接觸有毒物質(zhì)、是否飲酒，是否食用洋蔥，BPH有無(wú)及腫瘤分期等的關(guān)系，結(jié)果顯示有多個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明基因加上外部影響因素可以綜合影響Pca的發(fā)病，攜帶8q24(rs445114，C)TC基因型以及8q24(rs620861，T)TC基因型的人群Pca易感性與食用洋蔥負(fù)相關(guān)(P1=0.007，OR=0.31，95%CI=0.12 ～0.79;P2=0.005，OR=0.30，95%CI=0.11 ～ 0.77)，攜帶8q24(rs6983267，G)TG基因型的人群Pca易感性與飲酒正相關(guān)(P=0.007，OR=10.75，95%CI=1.35 ～ 86.14)。眾多的研究已經(jīng)表明基因環(huán)境交互作用對(duì)于疾病的發(fā)生和進(jìn)展具有重要作用，有的會(huì)起到協(xié)同作用，有的會(huì)起到拮抗作用。對(duì)這些影響發(fā)病的因素進(jìn)行記錄并統(tǒng)計(jì)分析，得出的結(jié)果可以幫助疾病的預(yù)防。本文報(bào)道的結(jié)果對(duì)Pca的病因作為參考，Pca的研究還有待繼續(xù)研究。

1 Jemal A，Tiwari R，Murray T，et al.Cancer statistics，2004［J］.CA Cancer J Clin，2004，54(1):8229.

2 孫穎浩.我國(guó)前列腺癌的研究現(xiàn)狀［J］.中華泌尿外科雜志，2004，25(2):77280.

3 LI Lihua，GUO Zijian，HUA Dong，HE Jie，HUANG Zhaohui，ZHOU Xike，et al.CHINESE JOURNAL OF LABORATORY MEDICINE，2011，34(1).

4 Gudmundsson J，Sulem P，Manolescu A，et al.Genome-wide association study identifies a second prostate cancer susceptibility variant at 8q24［J］.Nat Genet，2007，39:631-637.

5 Yeager M，Orr N，Hayes RB，et al.Genome wide association study of prostate cancer identifies a second risk locus at 8q24［J］.Nat Genet，2007，39:645-649.

6 Crowther-Swanepoel D，Broderick P，Di Bernardo MC，et al.Common variants at 2q37.3，8q24.21，15q21.3 and 16q24.1 influence chronic lymphocytic leukemia risk［J］.Nat Genet，2010，42:132-136.

7 Ghoussaini M，Song H，Koessler T，et al.Multiple loci with different cancer specificities within the 8q24 gene desert［J］.J Natl Cancer Inst，2008，100:962-966.

8 Eeles RA，Kote-Jarai Z，Giles GG，et al.Multiple newly identified loci associated with prostate cancer susceptibility［J］.Nat Genet，2008，40:316-321.

9 Easton DF，Pooley KA，Dunning AM，et al.Genome-wide association study identifies novel breast cancer susceptibility loci［J］.Nature，2007，447:1087-1093.

10 Turnbull C，Ahmed S，Morrison J，et al.Genome-wide association study identifies five new breast cancer susceptibility loci［J］.Nat Genet，2010，42:504-507.

11 Thomas G，Jacobs KB，Yeager M，et al.Multiple loci identified in a genome-wide association study of prostate cancer［J］.Nat Genet，2008，40:310-315.

12 Eeles RA，Kote-Jarai Z，Al Olama AA，et al.Identification of seven new prostate cancer susceptibility loci through a genome-wide association study［J］.Nat Genet，2009，41:1116-1121.

13 Yeager M，Xiao N，Hayes RB，et al.Comprehensive resequence analysis of a 136 kb region of human chromosome 8q24 associated with prostate and colon cancers［J］.Hum Genet，2008，124:161-170.

14 Heintzman ND，Hon GC，Hawkins RD，et al.Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression［J］.Nature，2009，459:108-112.

15 Wasserman NF，Aneas I，Nobrega MA.An 8q24 gene desert variant associated with prostate cancer risk confers differential in vivo activity to a MYC enhancer［J］.Genome Res.Epub，2010，13.

16 Sotelo J，Esposito D，Duhagon MA，et al.Longrange enhancers on 8q24 regulate c-Myc［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107:3001-3005.

17 Pomerantz MM，Ahmadiyeh N，Jia L，et al.The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows longrange interaction with MYC in colorectal cancer［J］.Nat Genet，2009，41:882-884.