韓冠英，凌沛學，王鳳山

(1.山東大學 藥學院，山東 濟南 250012;2.山東省生物藥物研究院博士后科研工作站，山東 濟南 250101;3.遼寧醫(yī)學院 藥學院，遼寧 錦州 121001)

黃原膠純化工藝研究進展

韓冠英1，2，3，凌沛學1，2，王鳳山1

(1.山東大學 藥學院，山東 濟南 250012;2.山東省生物藥物研究院博士后科研工作站，山東 濟南 250101;3.遼寧醫(yī)學院 藥學院，遼寧 錦州 121001)

黃原膠在醫(yī)藥領域應用廣泛，可作為增稠劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、乳化劑和緩、控釋制劑的輔料等，作為藥用輔料被2010年中國藥典收載。黃原膠發(fā)酵液高黏度、高雜質和含量低的特點給純化造成困難。本文對黃原膠的純化工藝進行了綜述。

黃原膠;分離;純化

1 黃原膠簡介

黃原膠(xanthan gum)別名黃膠、漢生膠，又稱黃單胞多糖。20世紀50年代美國農業(yè)部北方研究室(Northern Regional Research Laboratories，NRRL)從野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)NRRL B-1459中發(fā)現此中性水溶性多糖。目前它是以糖類為主要原料，經發(fā)酵生產的一種微生物胞外雜多糖［1］，相對分子質量為2×106～2×107。黃原膠的基本結構是由重復的五糖單元組成(圖1)，此單元由2個D-葡萄糖、2個D-甘露糖和1個D-葡糖醛酸組成。黃原膠分子的一級結構是由β-1，4鍵連接的D-葡萄糖基主鏈與三糖單位側鏈組成，其側鏈由D-甘露糖和D-葡糖醛酸交替連接而成，部分側鏈末端的甘露糖4，6位C上連接1個丙酮酸基團，而部分連接主鏈的甘露糖在C-6位被乙?；?二級結構是側鏈通過氫鍵反向纏繞主鏈形成的雙螺旋或多螺旋結構;三級結構是二級結構通過非共價鍵組成的網狀結構。

黃原膠的結構決定其具有許多優(yōu)良特性:低濃度下高黏性、特殊的流變性、耐高溫、耐酸堿、抗酶解性及良好的增稠性、穩(wěn)定性和乳化性。黃原膠在醫(yī)藥領域中應用廣泛，可作為增稠劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、乳化劑和緩、控釋制劑的輔料等。

圖1 黃原膠分子結構

黃原膠的制備包括發(fā)酵、純化和制成成品三部分。其發(fā)酵液具有高黏度、高雜質和含量低的特點，給純化造成困難，使純化成本在總制備成本中占有很大的比例。其成品分工業(yè)粗品級、工業(yè)級、食品級和藥用輔料級4種，其中食品級和藥用輔料級因質量要求高，所以純化難度和成本高。本文綜述國內外黃原膠的純化工藝，為進一步探討成本低、效率高的純化工藝提供參考。

2 黃原膠純化工藝

黃原膠的純化包括發(fā)酵液預處理、固-液分離和沉淀分離3個步驟。

2.1 發(fā)酵液預處理

預處理主要是對發(fā)酵液中的菌體細胞、殘余糖、有機氮、色素及其他代謝產物等在分離黃原膠前進行處理。預處理的方法包括巴氏滅菌法、酶解法和吸附法等。

巴氏滅菌法能殺死病原菌，破壞細胞和酶，降低發(fā)酵液黏度，有利于后續(xù)純化工藝的進行［1］。黃成棟等［2］采用巴氏滅菌法進行預處理，由于溫度較高，可提高黃原膠的溶解度，降低溶液的黏度，利于隨后的離心或過濾。Homma等［3］調節(jié)發(fā)酵液pH 10～12，溫度50～60℃，處理30 min以上，消滅了細菌的活性，防止后續(xù)酶處理時酶失活。

雖然巴氏滅菌法操作簡單，但控制不好溫度會導致黃原膠降解。酶解法是在發(fā)酵液中加入蛋白酶或溶菌酶等降解細菌細胞壁，使菌體裂解成小片斷和水溶性的含氮化合物，在沉淀多糖時留在溶液中，與多糖分離?；具^程為:發(fā)酵液先加熱滅活，調至一定pH后，加入適量蛋白酶或溶菌酶，充分作用后進行過濾或離心，以去除大部分菌體。Thomas等［4］采用堿性蛋白酶和溶菌酶雙酶解的方法，得到了透光度達94%以上的黃原膠發(fā)酵液，確定了酶作用條件，包括時間、溫度和pH等。徐國華等［5］先將發(fā)酵液進行一次醇沉，過濾、溶解后采用堿性蛋白酶和溶菌酶雙酶解，然后將酶高溫滅活，進行二次醇沉，得到了高純度黃原膠。Joseph等［6］先在發(fā)酵液中加入螯合劑、表面活性劑和有機酸等一種或多種，調 pH 6.5～7.5、溫度50～60 ℃，用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶或蛋白酶和溶菌酶的混合酶處理0.5～2 h，最后過濾和離心，得到了透光度較高的發(fā)酵液。

酶解法雖然能得到高純度黃原膠，但操作步驟偏多，成本較高，不適合大規(guī)模生產。吸附法是在黃原膠發(fā)酵液中加入吸附劑以吸附菌體等雜質達到純化目的，吸附效果與吸附劑類型、用量、溫度、吸附時間及溶液pH有關。吸附法操作簡單，易于控制，適合大規(guī)模生產。朱圣東［7］在發(fā)酵液中加入1%硅藻土，吸附10 min。結果表明，黃原膠成品的質量明顯優(yōu)于酶解法，但收率略低。Yang等［8］利用纖維材料吸附黃原膠發(fā)酵液中大部分細菌及細胞碎片，提高了黃原膠純度，簡化了操作步驟，降低了成本。

2.2 固-液分離

固-液分離是將菌體細胞和不溶性雜質等從黃原膠發(fā)酵液中分離，常用的方法有離心法、過濾法和超濾法。

Riadh 等［9］以 12 000 r/min 離心 30 min，Sandra 等［10］以18 900×g離心30 min，Ieda等［11］在4 ℃以5 500 r/min離心40 min，去除了菌體細胞和不溶性雜質。離心法雖然可將菌體去除，但所需相對離心力較高，能耗較大，不適合大規(guī)模生產。過濾法是將發(fā)酵液加熱或適當稀釋以降低黏度，然后用助濾劑如硅藻土、珍珠巖等形成的濾餅或濾材如微孔濾膜等過濾，以達到去除菌體和不溶性雜質的目的。過濾法易于大規(guī)模生產。

離心法和過濾法雖然操作簡單，但常需大量稀釋發(fā)酵液，這會增加成本。超濾法是通過選擇一定孔徑的超濾膜，用超濾器將菌絲體、色素、殘余糖、有機氮、部分無機鹽等雜質與黃原膠分離，并進行濃縮，可去除較小的可溶性分子雜質，包括鹽類［12］。超濾法因提高黃原膠濃度，可降低純化成本并提高產品質量;產品處理時間短，避免黃原膠降解［13-14］。Beatriz等［14］在2.5% 黃原膠發(fā)酵液中添加了 1%氯化鉀和大于30%的異丙醇，提高了超濾速度并節(jié)省了醇用量，降低了成本。費利江等［15］通過預處理、超濾脫鹽、濃縮的工藝路線使黃原膠質量達到藥用輔料級要求:黏度1.5 Pa·s，總氮含量小于0.5%，灰分含量小于6%，大幅度提高了質量，并解決了質量不穩(wěn)定問題。Gaddy等［16］采用超濾法先濃縮黃原膠溶液，除去了大部雜質，在黃原膠濃度較高的情況下也取得了較好的純化效果。總之，在黃原膠純化工藝中用超濾法對黃原膠發(fā)酵液進行濃縮，對降低黃原膠分離費用及大規(guī)模推廣應用有積極的作用。

2.3 沉淀分離

黃原膠的分離多采用使其在溶液中溶解度降低的溶劑。沉淀法是簡單實用的分離方法，常用的有酸沉淀法、醇沉淀法和鹽-醇沉淀法。

黃原膠對酸堿穩(wěn)定，在pH 4～10之間性質無明顯變化。當pH＜3時可形成沉淀，絮凝析出，因此可通過酸沉淀法分離黃原膠。該法具有成本低，能耗省的優(yōu)點。但該法的酸用量不易控制，酸濃度過高易變性，過低則不易沉淀，在黃原膠的分離中已較少應用。

最常用的方法是醇沉淀法。黃原膠在多種液體中穩(wěn)定，它易溶于水，可溶于甘油、乙二醇、濃度低于40%的甲醇、乙醇和異丙醇。當醇濃度達60% ～70%時，黃原膠與水分子間的親和力減弱，其分子間的親和力增強，使之相互絮凝而形成沉淀與水分開，因此可用醇對黃原膠進行分離。常用的溶劑有小分子醇如甲醇、乙醇和異丙醇等，有利于脫色和去除低分子物質［17-18］。Riadh等［9］采用約3倍發(fā)酵液量的乙醇、Maria等［19］采用約1.44倍發(fā)酵液量的異丙醇沉淀黃原膠，都取得了好的效果。楊攫等［20］研究表明，分離黃原膠時，乙醇和異丙醇混合使用效果優(yōu)于單獨使用乙醇或異丙醇，當乙醇:異丙醇為3∶1時分離效果最好。

醇沉淀法雖然效果好，但醇消耗較多，成本較高。鹽-醇沉淀法是在黃原膠溶液中添加氯化鉀、氯化鈉等電解質，使陽離子與黃原膠分子的陰離子結合，降低黃原膠分子的電荷。Maria等［19］研究表明，加人無機鹽促進黃原膠在醇中沉淀，減少了醇用量，且黃原膠分離量增加了兩倍以上。Psomas等［21］添加氯化鉀至終濃度為5%，異丙醇用量大大減少，提高了產量，降低了成本。Yun等［22］研究表明，乙醇初步沉淀后用十六烷基三甲基溴化銨沉淀可得到較純多糖。目前，加入含低鹽濃度的有機試劑沉淀黃原膠是較常用的方法。

3 展望

菌種是提高黃原膠產量和質量的主要因素之一。好的菌種不僅可提高黃原膠的產量，且可降低發(fā)酵液中色素和雜質的含量，降低純化成本，提高產品質量。綜合運用誘變和基因工程等技術改良菌種并優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，可生產高質量藥用輔料級黃原膠，拓展其在醫(yī)藥領域的應用。

黃原膠發(fā)酵液性質不穩(wěn)定，易受空氣氧化、微生物污染及純化過程中pH、溫度等條件影響，脫去結構中的乙酸和丙酮酸而改變分子的聚集狀態(tài)，進而導致產物的性質及產量發(fā)生變化。因此需要不斷優(yōu)化純化工藝，盡量縮短時間，嚴格控制溫度及pH等條件，并減少其與空氣接觸的機會。

隨著黃原膠在醫(yī)藥領域的應用被不斷深入的研究，藥用輔料級黃原膠的市場需求量也不斷增加。因此需要改進或尋求新的操作簡單的適合生產的預處理和分離方法，并將兩者有機結合，以降低成本，提高產品質量和產量。

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Research progress in the purification of xanthan gum

HAN Guan-ying1，2，3，LING Pei-xue1，2，WANG Feng-shan1
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Postdoctoral Scientific Research Workstation，Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China;3.School of Pharmaceutical Science，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China)

TQ460.4;TQ929

A

1005-1678(2012)01-0087-03

2010-11-22

“泰山學者”建設工程專項經費資助

韓冠英，男，博士研究生，研究方向為多糖類藥物;凌沛學，通信作者，研究員，博士生導師，Tel:0531-81213003，E-mail:lpx@sdfmg.com。