王曉玉，劉 飛，顏 震，張 莉，朱希強(qiáng)，郭學(xué)平，凌沛學(xué)

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東省藥學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)中心，山東 濟(jì)南 250101)

浸麻芽孢桿菌環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶的克隆與表達(dá)

王曉玉1，2，劉 飛2，顏 震2，張 莉2，朱希強(qiáng)2，郭學(xué)平2，凌沛學(xué)1，2

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東省藥學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)中心，山東 濟(jì)南 250101)

目的 獲取浸麻芽孢桿菌環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因并在大腸桿菌中表達(dá)。方法 構(gòu)建浸麻芽孢桿菌環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選獲得陽(yáng)性重組菌株。經(jīng)42℃誘導(dǎo)后，檢測(cè)酶活性。結(jié)果浸麻芽孢桿菌環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中成功表達(dá)，表達(dá)量達(dá)3 U/mL。結(jié)論 浸麻芽孢桿菌環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以在大腸桿菌中高效表達(dá)。

環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶;浸麻芽孢桿菌;表達(dá);大腸桿菌

環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase，EC 2.4.1.19)是α-淀粉酶家族的重要成員，能將淀粉通過(guò)環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精［1］，且還可通過(guò)逆反應(yīng)將環(huán)糊精與維生素C結(jié)合生成維生素C葡糖苷［2］。環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、紡織、環(huán)保和分析化學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用［3］，維生素C葡糖苷也是化妝品生產(chǎn)領(lǐng)域重要的原料之一［4］。環(huán)糊精和維生素C葡糖苷的工業(yè)化生產(chǎn)均采用酶法合成，但由于野生菌株的產(chǎn)酶能力普遍較低，CGTase的產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，其應(yīng)用受到了很大限制，必須提高CGTase產(chǎn)量和活性。因此，基因工程方法生產(chǎn)CGTase越來(lái)越得到重視。目前已有利用大腸桿菌(E.coli)表達(dá)CGTase的報(bào)道，但多為包涵體，活性不高。本研究將浸麻芽孢桿菌(Bacillus macerans)的CGTase插入高效表達(dá)載體pBV220，對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 菌株和質(zhì)粒

Bacillus macerans為革蘭陽(yáng)性菌購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心;E.coli、DH5α克隆載體pUC19［Amp(氨芐青霉素)抗性］和表達(dá)載體pBV220(Amp抗性)均為山東省藥學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)中心保存。

1.2 工具酶和試劑(盒)

T4連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶、Taq酶和Probest高保真酶分別購(gòu)于 Fermentas和Takara公司。細(xì)菌基因組抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司和北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 引物設(shè)計(jì)和CGTase基因的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Bacillus macerans CGTase基因cgt的序列設(shè)計(jì)引物cgt1和cgt2(表1)，以Bacillus macerans基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得含有起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)的DNA片段。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件:94℃變性5 min;94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。瓊脂糖電泳后，回收大小正確的DNA片段，并與質(zhì)粒pUC19連接，得到質(zhì)粒pUC-cgt，測(cè)序。

表1 克隆和表達(dá)cgt所需的引物Tab.1 The primers for clone and expression of cgt

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

pBV220是一個(gè)高效表達(dá)載體，有3 666 bp，具有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，SD序列后緊接多克隆位點(diǎn)和強(qiáng)終止子，同時(shí)它受clts857基因調(diào)控。在溫度調(diào)控下，能大量表達(dá)目的蛋白。以質(zhì)粒pUC-cgt為模板，擴(kuò)增cgt基因，引物為cgt3～6(表1)，其中cgt3和cgt5為上引，cgt4和cgt6為下引。上引含有Eco RⅠ酶切位點(diǎn)，下引含有Bam HⅠ酶切位點(diǎn)。引物 cgt3和cgt4擴(kuò)增的是去掉信號(hào)肽的成熟肽，引物cgt5和cgt6擴(kuò)增的片段含有信號(hào)肽。通過(guò)Eco RⅠ和Bam HⅠ雙酶切，將 PCR擴(kuò)增獲得的外源片段插入pBV220的 λP1啟動(dòng)子的下游，帶有起始密碼子ATG的外源片段直接插在質(zhì)粒pBV220的SD序列的后面，得到質(zhì)粒 PBV-cgt，轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α，可表達(dá)非融合蛋白，結(jié)構(gòu)如圖1。

2.3 CGTase基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取一個(gè)轉(zhuǎn)化子單菌落接種于LB培養(yǎng)基5 mL中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日以2%接種量接于LB培養(yǎng)基200 mL中，30℃培養(yǎng)3～4 h，然后將溫度升至42℃，誘導(dǎo)4 h。

2.4 CGTase粗酶液的制備

圖1 大腸桿菌表達(dá)CGTase的質(zhì)粒Fig.1 The plasmid of CGTase gene in E.coli

將42℃誘導(dǎo)后的菌液4℃離心收集菌體，用0.05 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.0)洗滌兩次，再重懸于20 mL該緩沖液中，超聲波破碎菌體，離心收集上清，即得到粗酶液。

2.5 CGTase的酶活性測(cè)定方法

甲基橙法:取粗酶液0.1 mL，加入裝有預(yù)先用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)配制的10 g/L可溶性淀粉溶液0.9 mL的試管中，在40℃下反應(yīng)10 min后，加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL終止反應(yīng)，再加入用50 mmol/L磷酸緩沖液配制的0.1 mmol/L甲基橙溶液1 mL，在20℃下保溫15 min，在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。對(duì)應(yīng)α-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出環(huán)糊精濃度，1個(gè)酶活性單位定義為在上述條件下每1 min生成1μmol的α-環(huán)糊精所需的酶量。

3 結(jié)果

3.1 CGTase基因的鑒定

利用引物cgt1和cgt2得到一條2.2 kb左右的DNA片段(見(jiàn)圖2)，測(cè)序結(jié)果表明它含有編碼714個(gè)氨基酸的蛋白ORF，與理論值相符，N端含有27個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。

圖2 CGTase基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 The electrophoresis result of cgt PCR products

與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)道的序列有所不同(圖3)，在420～500 bp左右發(fā)生了移碼突變，導(dǎo)致編碼的氨基酸序列也隨之發(fā)生變化。這表明同一個(gè)種Bacillus macerans的CGTase基因也略有不同。但這部分肽段不是保守區(qū)，對(duì)活性影響不會(huì)很大。

3.2 CGTase的表達(dá)

篩選含有目的質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，42℃誘導(dǎo)表達(dá)后，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明所表達(dá)的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為70×103(圖4)，與根據(jù)核苷酸序列推測(cè)的蛋白質(zhì)Mr基本一致。取發(fā)酵液上清和菌體超聲波破碎后的上清，分別檢測(cè)酶活性。其中不帶有信號(hào)肽的發(fā)酵液上清檢測(cè)不到活性，菌體超聲破碎上清活性較高，約為3 U/mL。帶有信號(hào)肽的發(fā)酵液上清能檢測(cè)到活性，但較低，約0.1 U/mL，菌體超聲破碎后上清檢測(cè)不到活性。這說(shuō)明Bacillus macerans的信號(hào)肽在E.coli也適用，但是效率很低，分泌到胞外的很少，同時(shí)帶有信號(hào)肽也影響了蛋白的表達(dá)量。把信號(hào)肽去掉更適合在E.coli中表達(dá)。

圖3 cgt克隆基因與NCBI報(bào)道的序列比較Fig.3 The sequence comparisons of cgt cloning result and report in NCBI

圖4 SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 The SDS-PAGE result of expression products

圖5 CGTase酶活性隨誘導(dǎo)時(shí)間的變化情況Fig.5 The time-independent status of CGTase activity

3.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)CGTase表達(dá)量的影響

42℃誘導(dǎo)表達(dá)后間隔一定時(shí)間取樣，測(cè)定菌體超聲波破碎后上清的酶活性。由圖5可以看出，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性逐漸升高，4 h時(shí)達(dá)到最高，此后活性基本沒(méi)有變化。為了減少成本，將誘導(dǎo)時(shí)間確定為4 h。

4 討論

野生型菌株生產(chǎn)CGTase存在一些問(wèn)題，產(chǎn)量和活性低，純化工藝較復(fù)雜，一直制約著工業(yè)化生產(chǎn)。利用基因工程技術(shù)可以提高CGTase的產(chǎn)量，但要選擇好合適的表達(dá)系統(tǒng)。目前表達(dá)系統(tǒng)很多，有E.coli表達(dá)系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)以及動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等等。針對(duì)Bacillus macerans的CGTase，E.coli表達(dá)系統(tǒng)使用簡(jiǎn)便，周期短，更有利于產(chǎn)量和活性的提高。E.coli表達(dá)系統(tǒng)有多種表達(dá)載體，目前已有利用PET系列的載體對(duì)Bacillus macerans的CGTase進(jìn)行了表達(dá)，活性不高，約0.8 U/mL［5］。我們利用表達(dá)載體 pBV220 對(duì) Bacillus macerans的CGTase成功實(shí)現(xiàn)了在E.coli中的表達(dá)，活性達(dá)到3 U/mL，約為之前報(bào)道的4倍，為以后發(fā)酵罐規(guī)模制備CGTase奠定了基礎(chǔ)。

［1］Kitahata S，Tsuyama N，Okada S.Purification and some properties of cyclodextrin glycosyltransferase from a strain of Bacillus species［J］.Agric Biol Chem，1974，38:387-393.

［2］Aga H，Yoneyama M，Sakai S，et al.Synthesis of 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid by cyclomaltodextrin glucanotransferase from Bacillus stearothermophilus［J］.Agric Biol Chem，1991，55:1751-1756.

［3］Szejtli J.The cyclodextrins and their applications in biotechnology［J］.Carbohydr Polym，1990，12:375-392.

［4］Jun H K，Bae K M，Kim SK.Production of 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid using cyclodextrin glucanotransferase from Paenibacillus sp［J］.Biotech Lett，2001，23:1793-1797.

［5］Kim C I，Kim M D，Park Y C，et al.Refolding of Bacillus macerans cyclodextrin glucanotransferase expressed as inclusion bodies in recombinant Escherichia coli［J］.Microbiol Biotechnol，2000，10:632-637.

Clone and expression of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus macerans in Escherichia coli

WANG Xiao-yu1，2，LIU Fei2，YAN Zhen2，ZHANG Li2，ZHU Xi-qiang2，GUO Xue-ping2，LING Pei-xue1，2
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Biotechnology Center，Shandong Academy of Pharmaceutical Science，Jinan 250101，China)

Purpose To obtain the gene of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillusmacerans and to express it in Escherichia coli.Methods The expression plasmid of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus macerans was constructed，then it was transferred into Escherichia coli DH5α，and positive clones were obtained by screening.After induction，the enzyme activity was detected.Results The cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus macerans was successfully expressed in Escherichia coli，and the enzyme activity was 3 U/mL.Conclusion The cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus macerans can be expressed efficiently in Escherichia coli.

cyclodextrin glycosyltransferase;Bacillus macerans;expression;Escherichia coli

Q78

A

1005-1678(2012)01-0046-03

2010-11-23

“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助

王曉玉，女，碩士研究生，微生物與生化藥學(xué)專(zhuān)業(yè)，E-mail:xiaoyuw26@hotmail.com;凌沛學(xué)，通信作者，研究員，博士生導(dǎo)師，Tel:0531-81213003，E-mail:lpx@sdfmg.com。