周 栩，張 艷，趙鳳生

(上海交通大學 藥學院，上海 200240)

頭孢菌素類抗生素在乙腈/NaCl雙相體系中的分配

周 栩，張 艷，趙鳳生

(上海交通大學 藥學院，上海 200240)

目的 研究幾種頭孢菌素類抗生素在親水有機溶劑、無機鹽和水組成的雙相體系(乙腈/NaCl體系)中的分配規(guī)律。方法 用滴定法制作體系的相圖，HPLC測定頭孢菌素在兩相中的濃度。結(jié)果 頭孢菌素濃度和溫度對頭孢菌素的分配影響不大;NaCl濃度和乙腈濃度則有一定影響，兩者濃度的增加都使頭孢菌素向下相(鹽相)轉(zhuǎn)移;pH對頭孢菌素的分配有較大影響，pH很低時頭孢菌素主要分配在上相(乙腈相)，pH升高到3.8左右大部分頭孢菌素即轉(zhuǎn)移到下相。結(jié)論 通過調(diào)節(jié)pH，用親水有機溶劑/鹽雙相體系萃取分離頭孢菌素類抗生素是可行的。

親水有機溶劑/鹽雙相體系;分配;頭孢菌素

在生化分離領(lǐng)域，雙水相萃取技術(shù)已經(jīng)引起了人們極大的重視。雙水相萃取體系是2種化學結(jié)構(gòu)不同的親水性高聚物或者1種親水性高聚物和1種無機鹽在水中以適當?shù)臐舛刃纬苫ゲ幌嗳艿膬蓪右合?，利用生物物質(zhì)在兩種水相間分配系數(shù)的差異可以進行萃取分離。雙水相萃取分離技術(shù)由于條件溫和、容易放大、可連續(xù)操作，被廣泛用于生物化學、生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取。傳統(tǒng)的雙水相體系多為聚乙二醇/右旋糖酐或聚乙二醇/磷酸鹽組成。由于水溶性高聚物難以揮發(fā)，黏度較大，不易操作，常給后續(xù)處理帶來困難。右旋糖酐等水溶性高聚物價格昂貴，操作成本高。事實上，可與水以任何比例混溶的親水有機溶劑(如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈)在無機鹽存在的條件下也可與水生成雙相體系。用這種雙相體系萃取分離化學物質(zhì)和生物物質(zhì)在國內(nèi)外剛起步，但已顯示出很多優(yōu)點:溶劑豐富價廉，環(huán)境友好溫和，所用試劑低毒或無毒、低殘留、低黏度，傳質(zhì)和分相速度快，乳化現(xiàn)象少。已經(jīng)用于萃取分離金屬絡(luò)合物或金屬離子［1-2］、植物有效成分［3-6］、蛋白質(zhì)和酶等生物大分子物質(zhì)［7］。

本文考察了頭孢噻肟鈉、頭孢呋辛鈉、頭孢唑啉鈉、頭孢哌酮鈉(圖1)等4種頭孢菌素在乙腈/NaCl雙相體系中的分配情況。

圖1 4種頭孢菌素類抗生素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of four kinds of cephalosporins

1 材料和儀器

頭孢呋辛鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司);頭孢噻肟鈉、頭孢唑啉鈉(哈藥集團三精制藥有限公司);頭孢哌酮鈉(中諾藥業(yè)石家莊有限公司);乙腈、氯化鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

AB204-N型電子分析天平(梅特勒-托利多(中國)集團);電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠);1100系列高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。

2 方法

2.1 測定乙腈/NaCl體系的相圖

將乙腈5 mL裝入錐形瓶，用NaCl溶液滴定。隨著NaCl溶液的加入，溶液由澄清變?yōu)闇啙幔涗浖尤隢aCl溶液的體積。加入適量水，溶液變澄清，繼續(xù)滴加NaCl溶液，溶液又變渾濁。如此重復(fù)，直到一次加入NaCl溶液25 mL后液體不變渾濁為止。滴定第一次時，由于乙腈濃度很高，為避免滴定過量，用0.1 g/mL NaCl溶液滴定，以后用 0.3 g/mLNaCl溶液滴定。根據(jù)每次滴定所加入的NaCl溶液體積，計算溶液中乙腈和NaCl的濃度，作出相圖的右邊一半(高濃度乙腈、低濃度NaCl的一半)。

相圖的左邊一半應(yīng)該用乙腈滴定NaCl溶液。如果采用上述滴定后加水再次滴定的方法，滴定所需要的乙腈量會很大，所以采用分次滴定的方法:取若干個錐形瓶，各加入0.3 g/mL NaCl溶液4 mL，再加入不同體積的水，分別用乙腈滴定，直至溶液渾濁。計算溶液中乙腈和NaCl的濃度，作出相圖的左邊一半(低濃度乙腈、高濃度NaCl的一半)。

溶液的密度用比重瓶測定。根據(jù)密度將滴定體積換算為質(zhì)量。

2.2 雙相體系分配頭孢菌素

在刻度試管中加入一定量的乙腈、NaCl溶液和頭孢菌素溶液，加入水到10 mL，用酸或堿調(diào)節(jié)pH值，混合均勻后置于恒溫水浴中。等分相達到穩(wěn)定后，記錄兩相的體積，從上下相各取一定體積的樣品，離心后用HPLC測定頭孢菌素的濃度。

2.3 HPLC測定頭孢菌素

柱溫為35℃，檢測波長為254 nm，色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)柱。流動相:0 ～18.5 min 為水-甲醇-0.01 mol/L NaH2PO4溶液(66∶16∶18);18.5 ～ 23.8 min 為水-甲醇-0.01 mol/L NaH2PO4溶液(50∶40∶10)。流速:1 mL/min。

2.4 分配系數(shù)、相比和收率的計算

頭孢菌素的分配系數(shù)=(上相中某種頭孢菌素類抗生素的濃度)/(下相中同種頭孢菌素類抗生素的濃度)。

雙水相體系的相比=(分相后上相體積)/(分相后下相體積)。

頭孢菌素在某一相的收率(%)=某一相中的頭孢菌素量/兩相中的頭孢菌素總量。

3 結(jié)果和討論

3.1 乙腈/NaCl體系的相圖

用滴定法測定的乙腈/NaCl體系的相圖如圖2。

圖2 乙腈/NaCl體系相圖Fig.2 Phase diagram of acetonitrile/NaCl system

相圖的左半段表示下相的組成，含較多的水和NaCl，含乙腈較少;相圖的右半段表示上相的組成，含乙腈較多，含NaCl較少。上相的親水性雖小于下相，但高于疏水溶劑(正己烷、苯、氯仿等)，因為其中含有的水份遠高于疏水溶劑中水的溶解度。

溫度升高時相圖略向上移，表明溫度高時分相所需NaCl濃度和乙腈濃度稍微高一些。

3.2 頭孢菌素類抗生素的濃度對分配的影響

在以下的實驗中，除了特別指明外，雙相體系分配頭孢菌素的條件如下:雙相體系中含每種頭孢菌素各 5 mg、NaCl 0.8 g、乙腈 5.5 mL、水 4.5 mL，pH 5.7 ～5.9(自然 pH)，35℃。

用不同濃度的頭孢菌素類抗生素加入雙相體系中，考察其在雙相中的分配和相比，結(jié)果見表1。

各種頭孢菌素在0.4～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)分配系數(shù)大體不變，這符合分配定律。頭孢呋辛鈉和頭孢哌酮鈉的分配系數(shù)較高，而頭孢噻肟鈉和頭孢唑啉鈉的分配系數(shù)較低，說明前兩者的疏水性大于后兩者。在頭孢菌素濃度0.2～0.4 mg/mL范圍，分配系數(shù)隨濃度的增加而減少，說明頭孢菌素濃度很低時不符合分配定律。在整個試驗濃度范圍內(nèi)，各種頭孢菌素的分配系數(shù)均小于1，因為這4種頭孢菌素類抗生素均為極性化合物，所以主要聚集于下相(鹽相)。

相比變化不大，說明頭孢菌素濃度對相比沒有太大影響。

3.3 溫度對頭孢菌素分配的影響

考察不同溫度下頭孢菌素在雙相體系中的分配，結(jié)果見表2。

表1 頭孢菌素濃度對分配和相比的影響Tab.1 Effect of cephalosporin concentration on partition and phase ratio

在乙腈/NaCl體系中，各種頭孢菌素的分配系數(shù)隨著溫度的升高而逐漸上升，但上升幅度不大，原因可能是溫度升高增加了頭孢菌素在上相的溶解度。相比變化也不大，維持在0.8左右。這說明溫度對乙腈/NaCl體系的影響較小。

3.4 NaCl濃度對頭孢菌素分配的影響

固定雙相體系的其它條件，加入不同量的NaCl，考察鹽濃度對頭孢菌素分配的影響。結(jié)果見圖3。

實驗中所選取的鹽的最低濃度接近雙相能分相的最低鹽濃度，鹽的最高濃度則接近雙相能分相且鹽剛析出時的濃度。從圖3可以看到，隨著鹽濃度的升高，分配系數(shù)都呈下降的趨勢。原因是隨著鹽濃度的升高，下相的極性逐漸增大，頭孢菌素作為極性較高的物質(zhì)，更多地聚集在下相。鹽濃度增加時相比略有增加，原因可能是下相中高濃度的鹽將乙腈排擠到上相，使相比增大。

3.5 乙腈濃度對頭孢菌素分配的影響

表2 溫度對分配和相比的影響Tab.2 Effect of temperature on partition and phase ratio

圖3 NaCl濃度對分配和相比的影響Fig 3 Effect of NaCl concentration on partition and phase ratio

固定雙相體系的其它條件，在水1.5 mL中加入NaCl 0.2 g和不同量的乙腈，考察乙腈濃度對頭孢菌素分配的影響。結(jié)果見圖4。

圖4 乙腈濃度對分配和相比的影響Fig 4 Effect of acetonitrile concentration on partition and phase ratio

乙腈濃度的選擇范圍，是從分相所需的最低乙腈濃度，到可以分相而NaCl未析出所能達到的最高乙腈濃度。由圖4可知，隨著乙腈濃度的增加，相比較快上升，因為上相是有機相，乙腈濃度的提高使上相體積增長，因而相比有明顯增加。由于上相有機溶劑濃度的增加，極性減弱，促使極性的頭孢菌素向下相轉(zhuǎn)移，因而分配系數(shù)逐漸降低。

3.6 pH值對頭孢菌素分配的影響

各種pH值下頭孢菌素在雙相體系中的分配情況見表3。

從表3可知，溶液的pH是對乙腈/NaCl體系中頭孢菌素的分配系數(shù)影響最大的因素。pH值由1.87上升到3.81時，4種頭孢菌素的分配系數(shù)均由遠大于1急劇減小到小于1，即大部分頭孢菌素由上相轉(zhuǎn)移到了下相。但pH從3.81變化到9.55時，分配系數(shù)變化不大，均小于1，頭孢菌素主要分配于下相，這和頭孢菌素為酸性物質(zhì)有關(guān)。

溶液的pH值上升時，相比增加，表明此時鹽對乙腈的排斥作用增大。

為比較不同pH值下頭孢菌素在親水有機溶劑/鹽雙相體系與疏水有機溶劑/水雙相體系中的分配情況，用乙酸丁酯和水配制疏水有機溶劑/水雙相體系，組成為:乙酸丁酯5 mL、水5 mL，含每種頭孢菌素各5 mg，調(diào)節(jié)到不同pH，在35℃考察頭孢菌素在其中的分配。由于在HPLC測定時，乙酸丁酯的出峰位置與頭孢哌酮鈉的出峰位置重合，干擾頭孢哌酮鈉的測定，所以去除頭孢哌酮鈉，只選其它3種頭孢菌素進行實驗。結(jié)果見表4。

在 pH 1.74～3.36范圍內(nèi)，乙酸丁酯/水雙相體系中分配系數(shù)隨pH的升高而急劇降低，即在此pH范圍，pH增高使頭孢菌素的極性增加，于是從上相(有機相)轉(zhuǎn)移到下相(水相)。在pH 3.36以上，分配系數(shù)很低。相比變化不大，表明乙酸丁酯和水的互溶度不隨pH而變化。

表3 pH對分配和相比的影響Tab.3 Effect of pH on partition and phase ratio

表4 pH對乙酸丁酯/水雙相體系中頭孢菌素的分配和相比的影響Tab.4 Effect of pH on partition and phase ratio of cephalosporins in n-butyl acetate/water two-phase system

將表3和表4比較，在乙腈/NaCl雙相體系中，頭孢菌素在低pH時的分配系數(shù)都遠大于1，說明上相有一定的親水性;而在乙酸丁酯/水雙相體系中，幾種頭孢菌素的分配系數(shù)始終小于1，因為乙酸丁酯的疏水性強。因此，使用乙腈/NaCl體系，可以在酸性條件下將頭孢菌素萃取到上相，而在中性或堿性條件下將頭孢菌素反萃取到下相，實現(xiàn)頭孢菌素的萃取分離。用乙酸丁酯/水體系，由于難以將大部分頭孢菌素萃取到上相，不能用在頭孢菌素提取中。目前生產(chǎn)上提取頭孢菌素主要使用大孔樹脂吸附和離子交換相結(jié)合的方法。本文提出的方法為頭孢菌素的液-液萃取提出了一條新的途徑。

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Partition of cephalosporins in acetonitrile/NaCl two-phase system

ZHOU Xu，ZHANG Yan，ZHAO Feng-sheng
(School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China)

Purpose To investigate the partition of several kinds of cephalosporins in two-phase system composed of hydrophilic organic solvent，inorganic salt and water，such as acetonitrile/NaCl system.Methods The phase diagram of acetonitrile/NaCl system was made by titration.Cephalosporin concentration was determined by HPLC.Results Cephalosporin concentration and temperature affected the partition of cephalosporins a little.NaCl concentration and acetonitrile concentration affected the partition at certain degree.When these concentrations increased，cephalosporins were moved from top phase(acetonitrile phase)to bottom phase(salt phase).The effect of pH on the partition was great.At low pH，cephalosporins were distributed mainly at top phase.When pH increased to 3.8，most of cephalosporins were transferred to bottom phase.Conclusion It is practicable to extract cephalosporins by adjusting pH of the two-phase system.

hydrophilic organic solvent/salt two-phase system;partition;cephalosporin

TQ028.3;TQ460.72

A

1005-1678(2012)02-0113-05

2010-09-23

周 栩，女，碩士研究生，研究方向為生物物質(zhì)的分離純化;趙鳳生，通信作者，Tel:021-34204528，E-mail:fszhao@sjtu.edu.cn。