王桂蘭，張曉元，陳曉燕，朱希強(qiáng)，凌沛學(xué)

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東省生物藥物研究院博士后科研工作站，山東 濟(jì)南 250101)

野油菜黃單胞菌中g(shù)um D基因的過(guò)表達(dá)對(duì)產(chǎn)黃原膠的影響

王桂蘭1，2，張曉元2，陳曉燕2，朱希強(qiáng)1，2，凌沛學(xué)1，2

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東省生物藥物研究院博士后科研工作站，山東 濟(jì)南 250101)

目的 在野油菜黃單胞菌58(Xc58)中過(guò)量表達(dá)產(chǎn)膠基因gum D，提高黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量和質(zhì)量。方法通過(guò)PCR擴(kuò)增、重組質(zhì)粒構(gòu)建、三親本接合等方法，將重組質(zhì)粒pBBR-gum D轉(zhuǎn)入原始菌Xc58。結(jié)果 工程菌與原始菌相比，黃原膠產(chǎn)量提高11.19%，黏度提高6.31%，重均分子質(zhì)量提高20.21%，乙?；刻岣?7.07%，丙酮酸含量下降6.34%。結(jié)論 改造后的菌株的黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量和質(zhì)量都較原始菌株有所提高。

黃原膠;gum D;重組菌株

黃原膠(xanthan gum)是由野油菜黃單胞菌或甘藍(lán)黑腐病黃單胞菌，以糖類為主要原料，經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生的一種胞外多糖。它由五糖重復(fù)單元組成，此單元中D-葡萄糖、D-甘露糖和D-葡糖醛酸的摩爾比為2∶2∶1。甘露糖上不同程度地被乙?；捅嵝揎棧?］。有研究表明，乙?；鶎?duì)黃原膠分子構(gòu)象有穩(wěn)定效應(yīng)，而丙酮酸利于分子間交聯(lián)［2］。因黃原膠具有獨(dú)特的增稠性、觸變性和穩(wěn)定性，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、陶瓷、石油等多種行業(yè)［3］。近年來(lái)，黃原膠的生產(chǎn)水平和規(guī)模在不斷提高，具有很大的商業(yè)前景［4］。

目前，國(guó)外黃原膠的研究熱點(diǎn)主要針對(duì)黃原膠發(fā)酵反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和代謝網(wǎng)絡(luò)分析，從各個(gè)角度闡述黃原膠的高產(chǎn)機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上改進(jìn)工藝，提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量［5］。產(chǎn)黃原膠基因陸續(xù)被分離、測(cè)序，其中g(shù)um基因簇被認(rèn)為是直接影響黃原膠結(jié)構(gòu)和組成的一類結(jié)構(gòu)基因。Katzen等［6］通過(guò)基因敲除的方法對(duì)12個(gè)gum相關(guān)基因(B-M)的產(chǎn)膠功能進(jìn)行了鑒定。通過(guò)過(guò)量表達(dá)部分gum相關(guān)基因，獲得具有遺傳穩(wěn)定性的黃原膠基因工程菌株，可生產(chǎn)不同結(jié)構(gòu)和組成的黃原膠。目前，尚未見(jiàn)利用基因工程改造黃原膠生產(chǎn)菌種用于工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)［7］，產(chǎn)膠基因gum D可表達(dá)葡糖轉(zhuǎn)移酶，在黃原膠合成過(guò)程中，調(diào)控第一個(gè)葡萄糖殘基與脂質(zhì)中間體的連接，是黃原膠合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)過(guò)量穩(wěn)定表達(dá)gum D基因，試圖得到優(yōu)于原始菌產(chǎn)膠能力的工程菌，提高黃原膠產(chǎn)量和質(zhì)量。

1 材料

野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris 58)，大腸桿菌(E.coli Top10)及質(zhì)粒pBBR-MCS-5均由本實(shí)驗(yàn)室保存;pRK2073質(zhì)粒由美國(guó)華盛頓大學(xué)Ekaterina Latypova教授惠贈(zèng)。

YM培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基分別用于Xc58種子及E.coli培養(yǎng);10 L發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉6%，豆餅粉0.4%，碳酸鈣 0.4%，硫酸鎂 0.2%，氯化錳0.02%，谷氨酸鈉0.1%。

限制性內(nèi)切酶HindⅢ、Taq酶(TaKaRa公司);凝膠試劑盒(北京天根生物技術(shù)公司)。

DAWN EOS多角度激光散射儀(Wyatt technology corp，USA);DV-E 黏度計(jì)(Brookfield，USA)

2 方法

2.1 gum D基因的克隆及分析

根據(jù)GenBank公布的Xc58全基因核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)引物 gum D1:5'CCCAAGCTTATGCTTTTGGCAGACTTGAG 3'，gum D2:5'CCCAAGCTTTCAGTACGCGGTCTTCTGTC 3'，引 物兩端含有HindⅢ酶切位點(diǎn)，用于構(gòu)建表達(dá)載體。

2.2 DNA 的操作

PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒DNA的提取、純化、酶切、瓊脂糖凝膠電泳、DNA體外連接、轉(zhuǎn)化、三親本接合法等均按照文獻(xiàn)［8-9］方法進(jìn)行。

2.3 測(cè)序

對(duì)驗(yàn)證正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序，以判斷構(gòu)建的重組質(zhì)粒中是否含有完整的gum D基因，由博尚生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序并進(jìn)行序列分析。

2.4 質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)參照Meacock介紹的方法［10］進(jìn)行。將30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜的菌液，以10%量接種于含慶大霉素(Gm)30μg/mL的YM培養(yǎng)基100 mL中，培養(yǎng)12 h后，轉(zhuǎn)接到無(wú)Gm的YM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)兩代后，將培養(yǎng)物稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取稀釋液100μL涂布于普通YM瓊脂平板，48 h后，隨機(jī)挑取單菌落100個(gè)，轉(zhuǎn)種于含Gm的YM瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)48 h并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2.5 發(fā)酵液黏度測(cè)定

轉(zhuǎn)入gum D的工程菌株Xc58-D與原始菌株Xc58于10 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)72 h，發(fā)酵條件為:溫度30℃，轉(zhuǎn)速450 r/min，通氣速率15 L/min，pH 7.0。發(fā)酵結(jié)束，用s05號(hào)轉(zhuǎn)子30 r/min下測(cè)定發(fā)酵液黏度值。

2.6 發(fā)酵液產(chǎn)膠量測(cè)定

取發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后，12 000 r/min離心10 min除去菌體及剩余淀粉，上清液用兩倍體積乙醇沉淀黃原膠多糖，50℃真空干燥后稱重，并換算成單位重量發(fā)酵液中的含膠量。

2.7 黃原膠的純化

取發(fā)酵液適當(dāng)稀釋后，12 000 r/min離心10 min除去菌體，加入適量活性炭粉末，酸性條件下吸附1 h，硅藻土預(yù)涂布氏漏斗，抽濾取濾液，0.45μm濾膜過(guò)濾，將濾液用2倍無(wú)水乙醇沉淀，50℃真空干燥后稱重。

2.8 黃原膠分子質(zhì)量的測(cè)定

采用多角度激光散射儀測(cè)定黃原膠分子質(zhì)量:流動(dòng)相 0.2 mol/L NaCl溶液，流速 0.6 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣濃度0.05 mg/mL，進(jìn)樣量500 μL，黃原膠分子 dn/dc值為0.181［11］，得到的是重均分子質(zhì)量(MW)。

2.9 乙?；氨岷繙y(cè)定

乙?；捅岷繙y(cè)定分別采用2，4-二硝基苯腙比色法［12］和異羥肟酸比色法［13］。

3 結(jié)果

3.1 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)

以Xc58基因組DNA為模板，經(jīng)引物gum D-1/2擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示大小約為1.5 kb的單一條帶，見(jiàn)圖1，與預(yù)期大小相符。

3.2 pBBR-gum D重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ酶切純化后連接于同樣經(jīng)HindⅢ酶切的pBBR-MCS-5質(zhì)粒中獲得重組質(zhì)粒pBBR-gum D(圖2)。CaCl2轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取多個(gè)獨(dú)立的白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行電泳驗(yàn)證，選擇陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增片段及連接方向的正確性。

圖2 pBBR-gum D重組陽(yáng)性質(zhì)粒電泳圖Fig.2 pBBR-gum D positive recombinant plasmid by electrophoresis

3.3 Xc58-D基因工程菌株的構(gòu)建及質(zhì)粒穩(wěn)定性驗(yàn)證

將 Xc58、Top 10(pBBR-gum D)和 Top 10(pRK2073)以三親本接合方法在Gm抗性瓊脂平板上獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定序列正確。經(jīng)質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，該質(zhì)?？梢栽赬c58中穩(wěn)定存在，經(jīng)過(guò)三代72 h無(wú)抗性培養(yǎng)后，質(zhì)粒穩(wěn)定性100%，適合工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

3.4 黃原膠發(fā)酵過(guò)程中黏度及產(chǎn)量變化曲線

Xc58、Xc58-D經(jīng)10 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)72 h，每隔8 h取樣，分別測(cè)定發(fā)酵液黏度及產(chǎn)膠量，結(jié)果如圖3～4。

Xc58菌種最后發(fā)酵液的黏度為6 810 mPa·s(s05，30r/min)，產(chǎn)膠量為28.07g/kg。Xc58-D菌種發(fā)酵液的黏度為7 240 mPa·s(s05，30 r/min)，比Xc58 提高了6.31%，產(chǎn)膠量為31.21 g/kg，比 Xc58提高了11.19%。

圖3 Xc58和Xc58-D發(fā)酵液黏度曲線圖Fig.3 Fermentation broth viscosity curve by Xc58 and Xc58-D

圖4 Xc58和Xc58-D產(chǎn)膠量曲線圖Fig.4 Production curve of xanthan gum by Xc58 and Xc58-D

3.5 Xc58-D與Xc58產(chǎn)黃原膠質(zhì)量的比較

將上述發(fā)酵所得樣品進(jìn)行純化，分別配成1%的溶液，再測(cè)黏度。另外，取適量?jī)蓸悠贩勰?，分別測(cè)定 MW、乙?；氨岷?。結(jié)果見(jiàn)表 1。Xc58-D發(fā)酵的黃原膠經(jīng)純化后的黏度、MW、乙酰基含量比 Xc58分別提高了 5.26%，20.21% 和77.07%，丙酮酸含量則下降了6.34%。

表1 Xc58和Xc58-D發(fā)酵黃原膠質(zhì)量比較Tab.1 Quality comparison of xanthan gum from Xc58 and Xc58-D

4 討論

黃原膠的工業(yè)應(yīng)用主要依賴其較高的黏彈性及優(yōu)良的流變學(xué)性質(zhì)。這些性質(zhì)與黃原膠的分子質(zhì)量、乙?；捅岬鹊暮坑忻芮嘘P(guān)系，即分子質(zhì)量的大小及有關(guān)基團(tuán)的含量高低影響黃原膠的質(zhì)量。我國(guó)目前黃原膠的生產(chǎn)能力與國(guó)外相比尚有差距，我們?cè)谂μ岣唿S原膠的工業(yè)化產(chǎn)量的同時(shí)，更應(yīng)該注重質(zhì)量的提高［14］。

運(yùn)用基因工程的手段發(fā)現(xiàn)有利于提高黃原膠產(chǎn)量及質(zhì)量的基因，并能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定性遺傳，是實(shí)現(xiàn)黃原膠工業(yè)化突破的重要手段。gum D編碼黃原膠合成的關(guān)鍵酶，影響合成的起步階段。本研究證明了過(guò)量表達(dá)gum D可得到黏度和Mw更高的黃原膠，同時(shí)乙?；捅岷恳舶l(fā)生變化，為黃原膠品種多樣性的繼續(xù)研究提供借鑒。

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Effect of by overexpressing gum D in Xanthomonas campestris on the xanthan gum

WANG Gui-lan1，2，ZHANG Xiao-yuan2，CHEN Xiao-yan2，ZHU Xi-qiang1，2，LING Pei-xue1，2
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Postdoctoral Scientific Research Workstation，Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

Purpose To improve the yield and quality of xanthan gum by overexpressing gum D in Xanthomonas campestris 58(Xc58).Methods By PCR amplification，plasmid construction，triparental conjugation and other methods，pBBR-gum D was transformed into the original strain Xc58.Results Compared with Xc58，the recombinant strain Xc58-D has increased by 11.19%in the yield of xanthan gum，by 6.31%increased in viscosity，by 20.21%increased in molecular weight，and by 77.07%increased in acetyl content，but 6.34%decreased in pyruvate content.Conclusion The recombinant strain has a higher yield and improves the quality of xanthan gum.

xanthan gum;gum D;recombinant strain

TQ460.38

A

1005-1678(2012)02-0106-04

2011-07-19

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃(編號(hào):2008BAI63B08)

王桂蘭，女，碩士研究生，微生物與生化藥學(xué)專業(yè);凌沛學(xué)，男，通信作者，研究員，博士生導(dǎo)師 Tel:0531-81213003，E-mail:lpx@sdfmg.com。